王衛(wèi)遠 李俊芳 李志軍 王濤

（1.邯鄲市中心醫(yī)院免疫科，河北 邯鄲 056001；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科，安徽 蚌埠 233004）

強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是臨床免疫科最常見的疾病之一［1－4］。強直性脊柱炎是以脊柱和骶髂部關節(jié)及其周圍組織炎癥為主要癥狀的自身免疫性疾病［3－6］。流行病學和臨床研究發(fā)現(xiàn)全球強直性脊柱炎的發(fā)病率約為0.07%～0.5%左右［3－6］。目前認為，強直性脊柱炎的發(fā)病與遺傳、感染等多種因素密切相 關［3－6］。Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）屬于病原微生物模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族［7－10］。目前發(fā)現(xiàn)的TLR 包括1到10 共十種，其主要分布于不同的免疫細胞表面［7－10］。近期研究證 實類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等自身免疫性疾病患者外周血單核細胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）表面包括TLR2和TLR4在內的多種TLR 表達均有顯著異常［11－13］。故本研究旨在探討強直性脊柱炎患者與健康患者外周血單核細胞（PBMC）表面的TLR2 和TLR4表達差異及臨床意義。

1 對象和方法

1.1 一般資料 根據(jù)1984年紐約強直性脊柱炎斷診標準選取2013年10月至2015年1月我院收治的初次診斷為強直性脊柱炎患者40例（AS患者組），及門診體檢的健康患者40 例進行研究（健康對照組）［14］。同時排除患有嚴重細菌和病毒感染；肝腎功能不全；嚴重心肺功能不全；其他結蹄組織疾病和血液系統(tǒng)疾病等疾病，以及不愿配合和參加的患者。其中健康對照組40例，男29例，女11例，年齡（44.2±15.1）歲。AS患者組40例，男31例，女9例，年齡（42.2±16.6）歲。兩組患者性別和年齡等經統(tǒng)計學處理，差異無顯著性，具有可比性（P 均＞0.05）。本臨床研究經醫(yī)院倫理委員會批準并經受試者簽署知情同意書。

1.2 紅細胞沉降率（ESR）在首次就診時使用紅細胞沉降率自動化分析儀檢測樣本的ESR。

1.3 血漿C－反應蛋白（CRP）在首次就診時使用免疫比濁法對患者血漿中的CRP水平進行檢測。

1.4 外周血單核細胞（PBMC）的采集 在系統(tǒng)治療前，于晨間采取患者的靜脈血5ml。并使用Ficoll Pague PLUS試劑盒（GE Healthcare Life Sciences）分離和純化患者外周血單核細胞（PBMC）。

1.5 外周血單核細胞（PBMC）TLR2和TLR4mRNA 的檢測采 用qPCR 法檢測PBMC TLR2 和TLR4mRNA 表達水平。根據(jù)試劑盒說明書提取細胞的總RNA 并合成cDNA。并進行熒光定量PCR擴增，反應體系為25μl，使用β－actin作為內參照。引物序列如下：TLR2 正 義5′－GCC AAA GTC TTG ATT GAT TGG－3′，反 義5′－TTG AAG TTC TCC AGC TCC TG－3′；TLR4 正 義5′－TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG－3′，反 義5′－GAA ATG GAG GCA CCC CTT C－3′；β－actin：正 義：5′－CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT－3′，反 義：5′－ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA－3′。使 用2－ΔΔCt法對MCP－1和HMGB1mRNA 表達水平進行測定，ΔΔCt ＝（Ct，目標－Ct，β－actin）AS 患者組－（Ct，目標－Ct，β－actin）健康對照組［15］。

1.6 Western blot法檢測PBMC 中TLR2和TLR4蛋白表達水平 按照試劑盒操作要求，首先提取PBMC 中總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人抗體TLR2（1∶1000）、TLR4（1∶1000）和β－actin（1∶1200），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000），用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

1.7 統(tǒng)計分析 計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅細胞沉降率（ESR）和血漿C－反應蛋白（CRP）檢測 對2組患者紅細胞沉降率（ESR）和血漿C－反應蛋白（CRP）檢測分析后發(fā)現(xiàn)首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組ESR 和CRP較健康對照組患者顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），見表1。

表1 患者紅細胞沉降率（ESR）和血漿C－反應蛋白（CRP）比較（，n＝40）Table 1 Comparison of erythrocyte sedimentation rate and the serum level of C－reaction protein between the two groups

表1 患者紅細胞沉降率（ESR）和血漿C－反應蛋白（CRP）比較（，n＝40）Table 1 Comparison of erythrocyte sedimentation rate and the serum level of C－reaction protein between the two groups

注：與健康對照組相比較①P＜0.05。

2.2 外周血單核細胞（PBMC）TLR2表達水平 對2組患者外周血單核細胞（PBMC）TLR2 mRNA 和蛋白表達水平進行分析后發(fā)現(xiàn)。首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組TLR2 mRNA 和蛋白表達水平較健康對照組患者顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），見表2和圖1。

表2 外周血單核細胞TLR2和TLR4mRNA 和蛋白的表達水平（，n＝40）Table 2 The mRNA and protein expression of TLR2and TLR4in PBMC in the two groups

表2 外周血單核細胞TLR2和TLR4mRNA 和蛋白的表達水平（，n＝40）Table 2 The mRNA and protein expression of TLR2and TLR4in PBMC in the two groups

注：與健康對照組相比較①P＜0.05

圖1 TLR2蛋白的表達western blot結果Figure 1 The western blot results of TLR2in the two groups

2.3 外周血單核細胞（PBMC）TLR4表達水平 對2組患者外周血單核細胞（PBMC）TLR4 mRNA 和蛋白表達水平進行分析后發(fā)現(xiàn)。首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組TLR4 mRNA 和蛋白表達水平較健康對照組患者顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），見表2和圖2。

圖2 TLR4蛋白的表達western blot結果Figure 2 The western blot results of TLR2in two groups

3 討論

強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）作為臨床免疫科最常見的疾病之一，其全球發(fā)病率為0.07%至0.5%［1－4，16，17］。研究發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎是以脊柱和骶髂部關節(jié)及其周圍組織復發(fā)性非特異性炎癥反應為主要特點的自身免疫性疾病，其中以男性患者多見，男女比例約為3∶1［1－4，16，17］。大 于3 個月的慢性持續(xù)性背部疼痛是強直性脊柱炎最常見的臨床表現(xiàn)。同時其他還包括脊柱和骶髂關節(jié)晨僵以及脊柱活動度限制等臨床癥狀［1－4，16，17］。目前研究發(fā)現(xiàn)大部分的強直性脊柱炎患者存在顯著的免疫紊亂。強直性脊柱炎患者HLA－B27陽性率高達90%以上，而普通人群HLA－B27陽性率僅為4%至9%；同時，HLA－B27陽性者強直性脊柱炎患病率約為10%至20%，而普通人群患病率僅為0.1%至0.2%；HLAB27已成為診斷和鑒別診斷強直性脊柱炎的重要指標［18］。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1 和IL－6 等炎癥介質在強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色［11－13］。TNF－α可以有效促進單核巨噬細胞和中性粒細胞的活化和趨化，導致巨噬細胞等炎癥細胞進一步的釋放MCP－1等炎癥因子，同時還可以導致炎癥組織中血管內皮細胞的激活，促進炎癥細胞的粘附加重局部的炎癥反應［11－13］。目前抗TNF－α治療如英夫利昔單抗已廣泛應用于克羅恩病、類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）以及強直性脊柱炎的臨床治療，并取得了肯定的療效［19］。同時進一步的研究發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1和IL－6等炎癥介質的釋放主要受到TLR 信號通路的調控［10，15］。TLR 屬于病原 微生物模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族，其可以通過與病原體相關分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMP）結合誘導如NF－κB 和ERK 等下游的信號分子的活化，促進炎癥介質的釋放以及免疫細胞的激活［10，15］。近年來臨床研究也發(fā)現(xiàn)TLR 特別是TLR2和TLR4與類風濕性關節(jié)炎和萊姆關節(jié)炎（lyme arthritis）和骨性關節(jié)炎（osteoarthritis）等疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系［20－23］。Ultaigh SN 等的研究證實抗TLR2 治療可以有效抑制類風濕性關節(jié)炎患者滑膜組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IFN－γ 和IL－8 等炎癥介質的釋放，提 示TLR2過度激活和表達在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生過程中扮演著重要的角色［20］。Lee EY 等的研究發(fā)現(xiàn)TLR2的基因多態(tài)性與類風濕性關節(jié)炎密切相關［21］。同時Menghini R 等的研究顯示TLR4／NF－κB信號通路誘導的血管內皮細胞過度活化是導致類風濕性關節(jié)關節(jié)損傷的重要原因之一［22］。Dhaouadi T 等的研究也發(fā)現(xiàn)TLR4 的基因多態(tài)性與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生有密切聯(lián)系［23］。在本臨床研究中我們首先發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者紅細胞沉降率（ESR）和血漿C－反應蛋白（CRP）較對照組明顯升高，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。該結果表明強直性脊柱炎患者全身炎癥反應水平處于較高的水平。

同時我們提取患者外周血單核細胞（PBMC）進行分析后發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者PBMC TLR2和TLR4 mRNA 和蛋白表達水平較健康體檢患者顯著增加，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。該結果提示過度表達的TLR2 和TLR4很可能參與了強直性脊柱炎的發(fā)生和發(fā)展。并有可能是導致強直性脊柱炎患者體內TNF－α、IL－1和IL－6等炎癥介質過度釋放的重要原因。

4 結論

TLR2和TLR4在強直性脊柱炎患者外周血單核細胞表面的表達水平呈顯著性升高，提示TLR2 和TLR4與強直性脊柱炎發(fā)病可能存在密切的相關性。同時我們的結果提示TLR2 和TLR4表達水平有作為診斷強直性脊柱炎的潛在價值，但仍需進一步的研究證實。

［1］周溯.補陽還五湯合黃芪桂枝五物湯治療強直性脊柱炎的療效觀察［J］.西部醫(yī)學，2012，24（11）：2192－2194.

［2］瞿曉春.強直性脊柱炎46例X 線CT 診斷分析［J］.西部醫(yī)學，2011，23（04）：729－731.

［3］Smith JA.Update on ankylosing spondylitis：current concepts in pathogenesis［J］.Curr Allergy Asthma Rep，2015，15（1）：489.

［4］朱靜，楊南萍.風濕性疾病伴發(fā)周圍神經病的臨床分析［J］.西部醫(yī)學，2006，18（02）：171－172.

［5］Sveaas SH，Berg IJ，Provan SA，et al.Circulating levels of inflammatory cytokines and cytokine receptors in patients with ankylosing spondylitis：a cross－sectional comparative study ［J］.Scand J Rheumatol，2015，44（2）：118－124.

［6］Golder V，Schachna L.Ankylosing spondylitis：an update［J］.Aust Fam Physician，2013，42（11）：780－784.

［7］張偉義，朱濤.脂多糖LPS對糖尿病大鼠肺泡巨噬細胞RBD－2表達的影響［J］.西部醫(yī)學，2011，23（09）：1629－1633.

［8］Reuven EM，F(xiàn)ink A，Shai Y.Regulation of innate immune responses by transmembrane interactions：lessons from the TLR family［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1838（6）：1586－1593.

［9］Clark K.Protein kinase networks that limit TLR signaling［J］.Biochem Soc Trans，2014，42（1）：11－24.

［10］Zhu T，Wang DX，Zhang W，et al.Andrographolide protects against LPS－induced acute lung injury by inactivation of NF－κB［J］.PLoS One，2013，8（2）：e56407.

［11］Hu F，Li Y，Zheng L，et al.Toll－like receptors expressed by synovial fibroblasts perpetuate Th1and th17cell responses in rheumatoid arthritis［J］.PLoS One，2014，9（6）：e100266.

［12］de Aquino SG，Abdollahi－Roodsaz S，Koenders MI，et al.Periodontal pathogens directly promote autoimmune experimental arthritis by inducing a TLR2－and IL－1－driven Th17response［J］.J Immunol，2014，192（9）：4103－4111.

［13］Liu Y，Yin H，Zhao M，et al.TLR2and TLR4in autoimmune diseases：a comprehensive review［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2014，47（2）：136－147.

［14］van der Linden S，Valkenburg HA，Cats A.Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis.A proposal for modification of the New York criteria［J］.Arthritis Rheum，1984，27（4）：361－368.

［15］Xiao M，Zhu T，Zhang W，et al.Emodin ameliorates LPS－induced acute lung injury，involving the inactivation of NF－κB in mice［J］.Int J Mol Sci，2014，15（11）：19355－19368.

［16］Lawrence RC，F(xiàn)elson DT，Helmick CG，et al.Estimates of the Prevalence of Arthritis and Other Rheumatic Conditions in the United States，Part II［J］.Arthritis and Rheumatism，2008，58（1）：26－35.

［17］Dean LE，Jones GT，MacDonald AG，et al.Global prevalence of ankylosing spondylitis［J］.Rheumatology（Oxford），2014，53（4）：650－657.

［18］Colbert RA，Tran TM，Layh－Schmitt G.HLA－B27misfolding and ankylosing spondylitis［J］.Mol Immunol，2014，57（1）：44－51.

［19］Radner H，Aletaha D.Anti－TNF in rheumatoid arthritis：an overview［J］.Wien Med Wochenschr，2015，165（1－2）：3－9.

［20］Ultaigh SN，Saber TP，McCormick J，et al.Blockade of Tolllike receptor 2prevents spontaneous cytokine release from rheumatoid arthritis ex vivo synovial explant cultures［J］.Arthritis Res Ther，2011，13（1）：R33.

［21］Lee EY，Yim JJ，Lee HS，et al.Dinucleotide repeat polymorphism in intron II of human Toll－like receptor 2gene and susceptibility to rheumatoid arthritis［J］.Int J Immunogenet，2006，33（3）：211－215.

［22］Menghini R，Campia U，Tesauro M，et al.Toll－like receptor 4 mediates endothelial cell activation through NF－κB but is not associated with endothelial dysfunction in patients with rheumatoid arthritis［J］.PLoS One，2014，9（6）：e99053.

［23］Dhaouadi T，Sfar I，Haouami Y，et al.Polymorphisms of Tolllike receptor－4and CD14in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis［J］.Biomark Res，2013，1（1）：20.