王衛(wèi)遠 李俊芳 李志軍 王濤
(1.邯鄲市中心醫(yī)院免疫科,河北 邯鄲 056001;2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院風濕免疫科,安徽 蚌埠 233004)
強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)是臨床免疫科最常見的疾病之一[1-4]。強直性脊柱炎是以脊柱和骶髂部關節(jié)及其周圍組織炎癥為主要癥狀的自身免疫性疾病[3-6]。流行病學和臨床研究發(fā)現(xiàn)全球強直性脊柱炎的發(fā)病率約為0.07%~0.5%左右[3-6]。目前認為,強直性脊柱炎的發(fā)病與遺傳、感染等多種因素密切相 關[3-6]。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)屬于病原微生物模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)家族[7-10]。目前發(fā)現(xiàn)的TLR 包括1到10 共十種,其主要分布于不同的免疫細胞表面[7-10]。近期研究證 實類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)等自身免疫性疾病患者外周血單核細胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)表面包括TLR2和TLR4在內的多種TLR 表達均有顯著異常[11-13]。故本研究旨在探討強直性脊柱炎患者與健康患者外周血單核細胞(PBMC)表面的TLR2 和TLR4表達差異及臨床意義。
1.1 一般資料 根據(jù)1984年紐約強直性脊柱炎斷診標準選取2013年10月至2015年1月我院收治的初次診斷為強直性脊柱炎患者40例(AS患者組),及門診體檢的健康患者40 例進行研究(健康對照組)[14]。同時排除患有嚴重細菌和病毒感染;肝腎功能不全;嚴重心肺功能不全;其他結蹄組織疾病和血液系統(tǒng)疾病等疾病,以及不愿配合和參加的患者。其中健康對照組40例,男29例,女11例,年齡(44.2±15.1)歲。AS患者組40例,男31例,女9例,年齡(42.2±16.6)歲。兩組患者性別和年齡等經統(tǒng)計學處理,差異無顯著性,具有可比性(P 均>0.05)。本臨床研究經醫(yī)院倫理委員會批準并經受試者簽署知情同意書。
1.2 紅細胞沉降率(ESR)在首次就診時使用紅細胞沉降率自動化分析儀檢測樣本的ESR。
1.3 血漿C-反應蛋白(CRP)在首次就診時使用免疫比濁法對患者血漿中的CRP水平進行檢測。
1.4 外周血單核細胞(PBMC)的采集 在系統(tǒng)治療前,于晨間采取患者的靜脈血5ml。并使用Ficoll Pague PLUS試劑盒(GE Healthcare Life Sciences)分離和純化患者外周血單核細胞(PBMC)。
1.5 外周血單核細胞(PBMC)TLR2和TLR4mRNA 的檢測采 用qPCR 法檢測PBMC TLR2 和TLR4mRNA 表達水平。根據(jù)試劑盒說明書提取細胞的總RNA 并合成cDNA。并進行熒光定量PCR擴增,反應體系為25μl,使用β-actin作為內參照。引物序列如下:TLR2 正 義5′-GCC AAA GTC TTG ATT GAT TGG-3′,反 義5′-TTG AAG TTC TCC AGC TCC TG-3′;TLR4 正 義5′-TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG-3′,反 義5′-GAA ATG GAG GCA CCC CTT C-3′;β-actin:正 義:5′-CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT-3′,反 義:5′-ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA-3′。使 用2-ΔΔCt法對MCP-1和HMGB1mRNA 表達水平進行測定,ΔΔCt =(Ct,目標-Ct,β-actin)AS 患者組-(Ct,目標-Ct,β-actin)健康對照組[15]。
1.6 Western blot法檢測PBMC 中TLR2和TLR4蛋白表達水平 按照試劑盒操作要求,首先提取PBMC 中總蛋白,并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE),然后轉移至硝酸纖維素濾膜上,用脫脂奶粉封閉1h,分別加入鼠抗人抗體TLR2(1∶1000)、TLR4(1∶1000)和β-actin(1∶1200),4℃孵育過夜,洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000),用ECL進行顯色,用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。
1.7 統(tǒng)計分析 計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析,兩樣本均數(shù)多重比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 紅細胞沉降率(ESR)和血漿C-反應蛋白(CRP)檢測 對2組患者紅細胞沉降率(ESR)和血漿C-反應蛋白(CRP)檢測分析后發(fā)現(xiàn)首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組ESR 和CRP較健康對照組患者顯著升高,差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P 均<0.05),見表1。
表1 患者紅細胞沉降率(ESR)和血漿C-反應蛋白(CRP)比較(,n=40)Table 1 Comparison of erythrocyte sedimentation rate and the serum level of C-reaction protein between the two groups
表1 患者紅細胞沉降率(ESR)和血漿C-反應蛋白(CRP)比較(,n=40)Table 1 Comparison of erythrocyte sedimentation rate and the serum level of C-reaction protein between the two groups
注:與健康對照組相比較①P<0.05。
2.2 外周血單核細胞(PBMC)TLR2表達水平 對2組患者外周血單核細胞(PBMC)TLR2 mRNA 和蛋白表達水平進行分析后發(fā)現(xiàn)。首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組TLR2 mRNA 和蛋白表達水平較健康對照組患者顯著升高,差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P 均<0.05),見表2和圖1。
表2 外周血單核細胞TLR2和TLR4mRNA 和蛋白的表達水平(,n=40)Table 2 The mRNA and protein expression of TLR2and TLR4in PBMC in the two groups
表2 外周血單核細胞TLR2和TLR4mRNA 和蛋白的表達水平(,n=40)Table 2 The mRNA and protein expression of TLR2and TLR4in PBMC in the two groups
注:與健康對照組相比較①P<0.05
圖1 TLR2蛋白的表達western blot結果Figure 1 The western blot results of TLR2in the two groups
2.3 外周血單核細胞(PBMC)TLR4表達水平 對2組患者外周血單核細胞(PBMC)TLR4 mRNA 和蛋白表達水平進行分析后發(fā)現(xiàn)。首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組TLR4 mRNA 和蛋白表達水平較健康對照組患者顯著升高,差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P 均<0.05),見表2和圖2。
圖2 TLR4蛋白的表達western blot結果Figure 2 The western blot results of TLR2in two groups
強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)作為臨床免疫科最常見的疾病之一,其全球發(fā)病率為0.07%至0.5%[1-4,16,17]。研究發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎是以脊柱和骶髂部關節(jié)及其周圍組織復發(fā)性非特異性炎癥反應為主要特點的自身免疫性疾病,其中以男性患者多見,男女比例約為3∶1[1-4,16,17]。大 于3 個月的慢性持續(xù)性背部疼痛是強直性脊柱炎最常見的臨床表現(xiàn)。同時其他還包括脊柱和骶髂關節(jié)晨僵以及脊柱活動度限制等臨床癥狀[1-4,16,17]。目前研究發(fā)現(xiàn)大部分的強直性脊柱炎患者存在顯著的免疫紊亂。強直性脊柱炎患者HLA-B27陽性率高達90%以上,而普通人群HLA-B27陽性率僅為4%至9%;同時,HLA-B27陽性者強直性脊柱炎患病率約為10%至20%,而普通人群患病率僅為0.1%至0.2%;HLAB27已成為診斷和鑒別診斷強直性脊柱炎的重要指標[18]。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1 和IL-6 等炎癥介質在強直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[11-13]。TNF-α可以有效促進單核巨噬細胞和中性粒細胞的活化和趨化,導致巨噬細胞等炎癥細胞進一步的釋放MCP-1等炎癥因子,同時還可以導致炎癥組織中血管內皮細胞的激活,促進炎癥細胞的粘附加重局部的炎癥反應[11-13]。目前抗TNF-α治療如英夫利昔單抗已廣泛應用于克羅恩病、類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)以及強直性脊柱炎的臨床治療,并取得了肯定的療效[19]。同時進一步的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥介質的釋放主要受到TLR 信號通路的調控[10,15]。TLR 屬于病原 微生物模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)家族,其可以通過與病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)結合誘導如NF-κB 和ERK 等下游的信號分子的活化,促進炎癥介質的釋放以及免疫細胞的激活[10,15]。近年來臨床研究也發(fā)現(xiàn)TLR 特別是TLR2和TLR4與類風濕性關節(jié)炎和萊姆關節(jié)炎(lyme arthritis)和骨性關節(jié)炎(osteoarthritis)等疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系[20-23]。Ultaigh SN 等的研究證實抗TLR2 治療可以有效抑制類風濕性關節(jié)炎患者滑膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 和IL-8 等炎癥介質的釋放,提 示TLR2過度激活和表達在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生過程中扮演著重要的角色[20]。Lee EY 等的研究發(fā)現(xiàn)TLR2的基因多態(tài)性與類風濕性關節(jié)炎密切相關[21]。同時Menghini R 等的研究顯示TLR4/NF-κB信號通路誘導的血管內皮細胞過度活化是導致類風濕性關節(jié)關節(jié)損傷的重要原因之一[22]。Dhaouadi T 等的研究也發(fā)現(xiàn)TLR4 的基因多態(tài)性與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生有密切聯(lián)系[23]。在本臨床研究中我們首先發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者紅細胞沉降率(ESR)和血漿C-反應蛋白(CRP)較對照組明顯升高,差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P 均<0.05)。該結果表明強直性脊柱炎患者全身炎癥反應水平處于較高的水平。
同時我們提取患者外周血單核細胞(PBMC)進行分析后發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者PBMC TLR2和TLR4 mRNA 和蛋白表達水平較健康體檢患者顯著增加,差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P 均<0.05)。該結果提示過度表達的TLR2 和TLR4很可能參與了強直性脊柱炎的發(fā)生和發(fā)展。并有可能是導致強直性脊柱炎患者體內TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥介質過度釋放的重要原因。
TLR2和TLR4在強直性脊柱炎患者外周血單核細胞表面的表達水平呈顯著性升高,提示TLR2 和TLR4與強直性脊柱炎發(fā)病可能存在密切的相關性。同時我們的結果提示TLR2 和TLR4表達水平有作為診斷強直性脊柱炎的潛在價值,但仍需進一步的研究證實。
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