王衛(wèi)遠(yuǎn) 李俊芳 李志軍 王濤

（1.邯鄲市中心醫(yī)院免疫科，河北 邯鄲 056001；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽 蚌埠 233004）

強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是臨床免疫科最常見的疾病之一［1－4］。強(qiáng)直性脊柱炎是以脊柱和骶髂部關(guān)節(jié)及其周圍組織炎癥為主要癥狀的自身免疫性疾?。?－6］。流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn)全球強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病率約為0.07%～0.5%左右［3－6］。目前認(rèn)為，強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病與遺傳、感染等多種因素密切相 關(guān)［3－6］。Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）屬于病原微生物模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族［7－10］。目前發(fā)現(xiàn)的TLR 包括1到10 共十種，其主要分布于不同的免疫細(xì)胞表面［7－10］。近期研究證 實類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等自身免疫性疾病患者外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）表面包括TLR2和TLR4在內(nèi)的多種TLR 表達(dá)均有顯著異常［11－13］。故本研究旨在探討強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）表面的TLR2 和TLR4表達(dá)差異及臨床意義。

1 對象和方法

1.1 一般資料 根據(jù)1984年紐約強(qiáng)直性脊柱炎斷診標(biāo)準(zhǔn)選取2013年10月至2015年1月我院收治的初次診斷為強(qiáng)直性脊柱炎患者40例（AS患者組），及門診體檢的健康患者40 例進(jìn)行研究（健康對照組）［14］。同時排除患有嚴(yán)重細(xì)菌和病毒感染；肝腎功能不全；嚴(yán)重心肺功能不全；其他結(jié)蹄組織疾病和血液系統(tǒng)疾病等疾病，以及不愿配合和參加的患者。其中健康對照組40例，男29例，女11例，年齡（44.2±15.1）歲。AS患者組40例，男31例，女9例，年齡（42.2±16.6）歲。兩組患者性別和年齡等經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，差異無顯著性，具有可比性（P 均＞0.05）。本臨床研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并經(jīng)受試者簽署知情同意書。

1.2 紅細(xì)胞沉降率（ESR）在首次就診時使用紅細(xì)胞沉降率自動化分析儀檢測樣本的ESR。

1.3 血漿C－反應(yīng)蛋白（CRP）在首次就診時使用免疫比濁法對患者血漿中的CRP水平進(jìn)行檢測。

1.4 外周血單核細(xì)胞（PBMC）的采集 在系統(tǒng)治療前，于晨間采取患者的靜脈血5ml。并使用Ficoll Pague PLUS試劑盒（GE Healthcare Life Sciences）分離和純化患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）。

1.5 外周血單核細(xì)胞（PBMC）TLR2和TLR4mRNA 的檢測采 用qPCR 法檢測PBMC TLR2 和TLR4mRNA 表達(dá)水平。根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞的總RNA 并合成cDNA。并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl，使用β－actin作為內(nèi)參照。引物序列如下：TLR2 正 義5′－GCC AAA GTC TTG ATT GAT TGG－3′，反 義5′－TTG AAG TTC TCC AGC TCC TG－3′；TLR4 正 義5′－TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG－3′，反 義5′－GAA ATG GAG GCA CCC CTT C－3′；β－actin：正 義：5′－CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT－3′，反 義：5′－ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA－3′。使 用2－ΔΔCt法對MCP－1和HMGB1mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行測定，ΔΔCt ＝（Ct，目標(biāo)－Ct，β－actin）AS 患者組－（Ct，目標(biāo)－Ct，β－actin）健康對照組［15］。

1.6 Western blot法檢測PBMC 中TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平 按照試劑盒操作要求，首先提取PBMC 中總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人抗體TLR2（1∶1000）、TLR4（1∶1000）和β－actin（1∶1200），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1000），用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.7 統(tǒng)計分析 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞沉降率（ESR）和血漿C－反應(yīng)蛋白（CRP）檢測 對2組患者紅細(xì)胞沉降率（ESR）和血漿C－反應(yīng)蛋白（CRP）檢測分析后發(fā)現(xiàn)首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組ESR 和CRP較健康對照組患者顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見表1。

表1 患者紅細(xì)胞沉降率（ESR）和血漿C－反應(yīng)蛋白（CRP）比較（，n＝40）Table 1 Comparison of erythrocyte sedimentation rate and the serum level of C－reaction protein between the two groups

表1 患者紅細(xì)胞沉降率（ESR）和血漿C－反應(yīng)蛋白（CRP）比較（，n＝40）Table 1 Comparison of erythrocyte sedimentation rate and the serum level of C－reaction protein between the two groups

注：與健康對照組相比較①P＜0.05。

2.2 外周血單核細(xì)胞（PBMC）TLR2表達(dá)水平 對2組患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）TLR2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)。首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組TLR2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較健康對照組患者顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見表2和圖1。

表2 外周血單核細(xì)胞TLR2和TLR4mRNA 和蛋白的表達(dá)水平（，n＝40）Table 2 The mRNA and protein expression of TLR2and TLR4in PBMC in the two groups

表2 外周血單核細(xì)胞TLR2和TLR4mRNA 和蛋白的表達(dá)水平（，n＝40）Table 2 The mRNA and protein expression of TLR2and TLR4in PBMC in the two groups

注：與健康對照組相比較①P＜0.05

圖1 TLR2蛋白的表達(dá)western blot結(jié)果Figure 1 The western blot results of TLR2in the two groups

2.3 外周血單核細(xì)胞（PBMC）TLR4表達(dá)水平 對2組患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)。首次診斷未給予系統(tǒng)治療的AS患者組TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較健康對照組患者顯著升高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見表2和圖2。

圖2 TLR4蛋白的表達(dá)western blot結(jié)果Figure 2 The western blot results of TLR2in two groups

3 討論

強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）作為臨床免疫科最常見的疾病之一，其全球發(fā)病率為0.07%至0.5%［1－4，16，17］。研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎是以脊柱和骶髂部關(guān)節(jié)及其周圍組織復(fù)發(fā)性非特異性炎癥反應(yīng)為主要特點的自身免疫性疾病，其中以男性患者多見，男女比例約為3∶1［1－4，16，17］。大 于3 個月的慢性持續(xù)性背部疼痛是強(qiáng)直性脊柱炎最常見的臨床表現(xiàn)。同時其他還包括脊柱和骶髂關(guān)節(jié)晨僵以及脊柱活動度限制等臨床癥狀［1－4，16，17］。目前研究發(fā)現(xiàn)大部分的強(qiáng)直性脊柱炎患者存在顯著的免疫紊亂。強(qiáng)直性脊柱炎患者HLA－B27陽性率高達(dá)90%以上，而普通人群HLA－B27陽性率僅為4%至9%；同時，HLA－B27陽性者強(qiáng)直性脊柱炎患病率約為10%至20%，而普通人群患病率僅為0.1%至0.2%；HLAB27已成為診斷和鑒別診斷強(qiáng)直性脊柱炎的重要指標(biāo)［18］。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1 和IL－6 等炎癥介質(zhì)在強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色［11－13］。TNF－α可以有效促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化和趨化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)一步的釋放MCP－1等炎癥因子，同時還可以導(dǎo)致炎癥組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的粘附加重局部的炎癥反應(yīng)［11－13］。目前抗TNF－α治療如英夫利昔單抗已廣泛應(yīng)用于克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）以及強(qiáng)直性脊柱炎的臨床治療，并取得了肯定的療效［19］。同時進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)TNF－α、IL－1和IL－6等炎癥介質(zhì)的釋放主要受到TLR 信號通路的調(diào)控［10，15］。TLR 屬于病原 微生物模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族，其可以通過與病原體相關(guān)分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMP）結(jié)合誘導(dǎo)如NF－κB 和ERK 等下游的信號分子的活化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放以及免疫細(xì)胞的激活［10，15］。近年來臨床研究也發(fā)現(xiàn)TLR 特別是TLR2和TLR4與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和萊姆關(guān)節(jié)炎（lyme arthritis）和骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis）等疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系［20－23］。Ultaigh SN 等的研究證實抗TLR2 治療可以有效抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IFN－γ 和IL－8 等炎癥介質(zhì)的釋放，提 示TLR2過度激活和表達(dá)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程中扮演著重要的角色［20］。Lee EY 等的研究發(fā)現(xiàn)TLR2的基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)［21］。同時Menghini R 等的研究顯示TLR4／NF－κB信號通路誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞過度活化是導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)損傷的重要原因之一［22］。Dhaouadi T 等的研究也發(fā)現(xiàn)TLR4 的基因多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有密切聯(lián)系［23］。在本臨床研究中我們首先發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者紅細(xì)胞沉降率（ESR）和血漿C－反應(yīng)蛋白（CRP）較對照組明顯升高，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。該結(jié)果表明強(qiáng)直性脊柱炎患者全身炎癥反應(yīng)水平處于較高的水平。

同時我們提取患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者PBMC TLR2和TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較健康體檢患者顯著增加，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。該結(jié)果提示過度表達(dá)的TLR2 和TLR4很可能參與了強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生和發(fā)展。并有可能是導(dǎo)致強(qiáng)直性脊柱炎患者體內(nèi)TNF－α、IL－1和IL－6等炎癥介質(zhì)過度釋放的重要原因。

4 結(jié)論

TLR2和TLR4在強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血單核細(xì)胞表面的表達(dá)水平呈顯著性升高，提示TLR2 和TLR4與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病可能存在密切的相關(guān)性。同時我們的結(jié)果提示TLR2 和TLR4表達(dá)水平有作為診斷強(qiáng)直性脊柱炎的潛在價值，但仍需進(jìn)一步的研究證實。

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