張 雪，俸婷婷，黃俊飛，喬 楊，周 英*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

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降尿酸藥物篩選方法學(xué)研究進(jìn)展

張 雪1,2,3，俸婷婷1,2,3，黃俊飛1,2,3，喬 楊1,2,3，周 英1,2,3*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

降尿酸藥物的篩選方法分為體內(nèi)和體外篩選兩種。體內(nèi)篩選方法是建立高尿酸血癥動(dòng)物模型，體外篩選方法是建立腎小管上皮細(xì)胞模型和體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。目前體內(nèi)動(dòng)物模型篩選方法研究比較成熟，已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，體外酶抑制劑和細(xì)胞水平篩選尚需進(jìn)一步探索研究?？偨Y(jié)降尿酸藥物體內(nèi)外篩選方法，為新藥開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

降尿酸藥物；高尿酸血癥；腎小管上皮細(xì)胞；黃嘌呤氧化酶

尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物。人體內(nèi)80%尿酸是在體內(nèi)合成，或由次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶(XO)的作用下分解代謝產(chǎn)生，20%尿酸由攝入食物中的核蛋白或嘌呤分解代謝產(chǎn)生。尿酸主要經(jīng)腎臟排泄，以原形經(jīng)腎小球?yàn)V過進(jìn)入腎小管，經(jīng)過腎小管重吸收和再分泌，最后進(jìn)入集合管，經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出體外。當(dāng)嘌呤代謝異?；蚰I小管對(duì)尿酸的重吸收增加時(shí)，人體內(nèi)的尿酸總量會(huì)升高，引發(fā)一系列病癥。

人體內(nèi)血尿酸含量正常值為1 200mg，當(dāng)血尿酸含量超過正常范圍時(shí)，易導(dǎo)致高尿酸血癥，損害腎臟功能；當(dāng)血尿酸濃度過高時(shí)，易在關(guān)節(jié)部位形成結(jié)晶沉淀，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛而引發(fā)痛風(fēng)。此外，高尿酸血癥與血糖、血脂代謝密切相關(guān)，是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和高血壓的危險(xiǎn)因素，是冠心病患者死亡的獨(dú)立預(yù)警因子，在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[1]。

根據(jù)尿酸產(chǎn)生與排泄的機(jī)制，降尿酸的途徑主要包括減少尿酸生成、增加尿酸排泄、抑制尿酸重吸收。降尿酸藥物可通過建立高尿酸血癥動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)篩選，或建立腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)模型進(jìn)行體外篩選，還可直接在體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。本文主要對(duì)降尿酸藥物的體內(nèi)和體外篩選方法進(jìn)行綜述，為治痛風(fēng)新藥的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 降尿酸藥物體內(nèi)篩選方法

降尿酸藥物的體內(nèi)篩選方法為建立高尿酸血癥動(dòng)物模型，造模方法主要分為以下三種[2]：①直接攝入尿酸、高嘌呤食物或尿酸前體物質(zhì)，增加黃嘌呤氧化酶活性，促進(jìn)尿酸產(chǎn)生，形成高尿酸血癥模型；②通過給藥抑制尿酸排泄，增加血尿酸濃度，形成高尿酸血癥，常用藥物為腺嘌呤、煙酸等；③抑制尿酸酶活性。尿酸酶可氧化分解成尿酸，通過抑制或消除尿酸酶活性可增加血尿酸濃度，常用尿酸酶抑制劑為氧嗪酸。此外，還可利用基因工程技術(shù)，破壞小鼠尿酸酶基因，獲得尿酸酶缺乏的突變型小鼠高尿酸血癥模型[3]。

高尿酸血癥通常會(huì)伴有其他合并癥，引發(fā)一系列繼發(fā)性損傷，如糖脂代謝紊亂、痛風(fēng)、腎損傷及心血管疾病。因此，高尿酸血癥動(dòng)物模型可分為單純性高尿酸血癥模型和伴繼發(fā)性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型。

1.1 單純性高尿酸血癥動(dòng)物模型

單純性高尿酸血癥常用造模動(dòng)物為大鼠、小鼠。楊桂梅等[4]灌胃給予大鼠氧嗪酸，大鼠體內(nèi)尿酸含量明顯升高，且維持時(shí)間較長(zhǎng)，無腎功能損害。張培等[5]灌胃給予大鼠高酵母飼料及腺嘌呤溶液，皮下注射氧嗪酸乳懸液，獲得慢性高尿酸血癥模型，該模型穩(wěn)定、血尿酸含量高、維持時(shí)間長(zhǎng)。董靜[6]連續(xù)灌胃給予小鼠酵母膏和乙胺丁醇3周，獲得持久穩(wěn)定的高尿酸血癥模型。

1.2 伴繼發(fā)性損傷或合并癥的高尿酸血癥動(dòng)物模型

伴繼發(fā)性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型常用動(dòng)物為大鼠、小鼠、雞及鵪鶉。Stavric等[7]以氧嗪酸、尿酸混合飼料喂養(yǎng)大鼠，使其血尿酸含量升高，腎臟內(nèi)出現(xiàn)明顯的尿酸鹽結(jié)晶沉積、腎小管間質(zhì)纖維化及尿酸性梗阻型腎病。迪麗達(dá)爾·希力甫等[8]腹腔注射給予大鼠酵母膏和氧嗪酸，使其尿酸維持高濃度水平，且大鼠腎臟、心臟及動(dòng)脈發(fā)生形態(tài)和病理改變，是研究高尿酸血癥引起繼發(fā)性心血管病理損傷的良好模型。高碧珍等[9]以高糖、高脂飼料飼養(yǎng)大鼠，以腺嘌呤灌胃，可復(fù)制高尿酸血癥合并糖脂代謝紊亂模型。 匡紅艷[10]采用高蛋白質(zhì)、高鈣飼料飼喂雞并限水，雞的跗踝周徑明顯增大，獲得高尿酸痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。楊紅蓮等[11]采用尿酸、腺素混合飼料喂飼鵪鶉，獲得持續(xù)穩(wěn)定的高尿酸血癥模型，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，鵪鶉還伴發(fā)有糖、脂代謝紊亂，肝、腎功能損傷等病理表現(xiàn)。

2 降尿酸藥物體外篩選方法

降尿酸藥物的體外篩選方法為建立腎小管上皮細(xì)胞模型，還可直接在體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。尿酸進(jìn)入腎臟后，經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞頂模進(jìn)入上皮細(xì)胞，再經(jīng)細(xì)胞的基底膜進(jìn)入腎小管周圍的毛細(xì)血管，進(jìn)而回到體液中，當(dāng)尿酸重吸收量增大時(shí)，血漿中尿酸濃度便會(huì)升高。因此，通過建立腎小管上皮細(xì)胞(RTEC)模型，考察體外測(cè)定藥物對(duì)RTEC尿酸重吸收功能的影響，可篩選出降尿酸藥物。黃嘌呤氧化酶(XO)在尿酸生成過程中具有重要作用，其可催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進(jìn)而生成尿酸，XO還可直接催化黃嘌呤生成尿酸。因此，可在體外測(cè)定藥物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用，篩選降尿酸藥物。

2.1 腎小管上皮細(xì)胞模型

RTEC模型的建立可分為原代分離培養(yǎng)和細(xì)胞株培養(yǎng)兩種，各有優(yōu)缺點(diǎn)。原代分離的RTEC形態(tài)和特征保留完整，生物性狀變化不大，更接近體內(nèi)狀態(tài)，具有較好的特異性，且其分化程度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，是體外研究RTEC對(duì)尿酸吸收功能的最佳選擇。但原代分離的RTEC中雜細(xì)胞多，細(xì)胞純度不高，且原代分離的RTEC高度分化，僅能傳2～3代，需重復(fù)分離。細(xì)胞株的培養(yǎng)可無限增殖和傳代，但功能特征與體內(nèi)原始狀態(tài)差異較大，其尿酸吸收功能有一定改變，在篩選降尿酸藥物時(shí)具有一定的限制性。原代分離RTEC的介質(zhì)主要為人、大鼠、小鼠和兔腎臟，通過酶消化法獲取腎小管節(jié)段進(jìn)行組織培養(yǎng)，進(jìn)而獲取RTEC。腎小管節(jié)段的純化可采用細(xì)胞篩機(jī)械分離，或者percoll分離液梯度離心分離，也可兩者聯(lián)用。

臧路平等[12]取小鼠腎臟，切取腎皮質(zhì)剪碎研磨，采用Ⅰ型膠原酶消化，依次過50目、100目篩網(wǎng)，Per coll密度梯度離心分離腎小管節(jié)段進(jìn)行培養(yǎng)，獲得小鼠RTEC。然后采用分離的細(xì)胞進(jìn)行尿酸吸收功能測(cè)試，驗(yàn)證了該模型可用于體外篩選降尿酸藥物。嚴(yán)玉澄[13]取正常人腎皮質(zhì)的組織塊，采用無血清培養(yǎng)液直接培養(yǎng)，獲得了人近端腎小管上皮細(xì)胞。

RTEC可自發(fā)性或誘發(fā)性轉(zhuǎn)變?yōu)橛郎?xì)胞株，使用SV40病毒可有效誘導(dǎo)RTEC無限增殖[14]。目前實(shí)驗(yàn)室已獲得了高度專一的腎小管上皮細(xì)胞株，包括近曲腎小管細(xì)胞、髓袢升支細(xì)胞等[15]。

2.2 黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選

XO可催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化生成尿酸，并產(chǎn)生氧自由基，因此抑制XO活性即可達(dá)到降尿酸效果。在體外測(cè)定藥物對(duì)XO活性的影響，即可篩選XO抑制劑。XO活性的測(cè)定方法主要為紫外分光光度法，吸光度值越大，XO活性越高。此外，也可在反應(yīng)體系中加入氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)，NBT可與氧自由基產(chǎn)生紫色的甲臜，通過測(cè)定甲臜的吸光度可反映XO的活性。體外篩選XO抑制劑時(shí)，需考慮待測(cè)樣品的吸光度干擾，設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

朱深銀等[16]建立了XO抑制劑的高通量篩選模型，并篩選了71 760個(gè)化合物和初提物。黎莉等[17]利用體外XO抑制劑篩選方法，發(fā)現(xiàn)枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物對(duì)XO具有較強(qiáng)的抑制活性。

3 結(jié)語

尿酸水平升高可引發(fā)痛風(fēng)、腎功能損傷、心血管疾病及代謝綜合征等。隨著生活水平的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，因此篩選降尿酸藥物對(duì)高尿酸血癥的防治至關(guān)重要。

降尿酸藥物的篩選分為體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)篩選是建立高尿酸血癥動(dòng)物模型，給藥后進(jìn)一步篩選出具有降尿酸作用的藥物。體外篩選是建立腎小管上皮細(xì)胞模型和體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。腎小管上皮細(xì)胞模型的建立可選擇原代分離和細(xì)胞株培養(yǎng)，該模型藥物作用靶點(diǎn)精準(zhǔn)，數(shù)據(jù)直觀。黃嘌呤氧化酶抑制劑的體外篩選具有效率高、靈敏性好、作用準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

與體內(nèi)篩選方法相比，降尿酸藥物的體外篩選具有明顯的局限性，不能充分反映藥物的藥理作用以及機(jī)體對(duì)藥物的吸收代謝過程。但體外篩選方法可在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行降尿酸藥物的篩選，具有高效、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合高通量藥物的篩選。隨著體外篩選模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展以及新藥作用靶點(diǎn)的研究發(fā)掘，篩選模型將更加具有新穎性和實(shí)用性，將成為新藥開發(fā)的一個(gè)重要研究方向。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2014-11-26

貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目(貴大人基合字(2012)010號(hào))；貴州省國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合外G字[2013]7009號(hào))；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2012]2173號(hào))；貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目2012現(xiàn)代藥業(yè)計(jì)劃(筑科合同[2012204]9號(hào))；貴州省藥食同源植物資源研究開發(fā)中心(黔科合G字[2014]4003號(hào))；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(研農(nóng)2015020)

張雪(1990-)，女，貴州大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞旨八幚碜饔谩?/p>

周英(1971-)，女，博士，貴州大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。

R965.1

A

1673-2197(2015)06-0048-02

10.11954/ytctyy.201506021