許月娟

2011年發(fā)熱患者血檢瘧原蟲血片制作及染色過程回顧性分析

許月娟

為了提高瘧原蟲檢出率, 選取本院發(fā)熱患者末梢血制成厚薄血片進行染色鏡檢, 通過對血片的制作加以標(biāo)準(zhǔn)化, 染液嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)配置, 并對染色各步驟嚴(yán)格控制, 做出的血片染色良好, 背景清晰, 極大方便了瘧原蟲檢查, 提高了瘧原蟲檢查的工作效率。

瘧原蟲；血片；染色

瘧疾是由瘧原蟲寄生于人體、經(jīng)蚊傳播的寄生蟲病, 臨床表現(xiàn)以周期性發(fā)冷、發(fā)熱、出汗和脾大、貧血為特征。為按期實現(xiàn)本縣消除瘧疾任務(wù)目標(biāo), 落實好各項防治措施, 根據(jù)《山東省全球基金瘧疾項目兩年工作計劃》和《山東省消除瘧疾實施方案》的要求, 結(jié)合本縣實際防控, 制定了具體的技術(shù)方案, 對全縣各醫(yī)療衛(wèi)生單位的檢驗人員進行了全員培訓(xùn), 現(xiàn)將血片制作及染色過程中的注意事項總結(jié)如下。

1 血片制作之前, 一定要將玻片清洗干凈, 玻片的清潔與否影響血片的質(zhì)量。新載玻片常有游離堿質(zhì), 應(yīng)用清洗液或10%鹽酸或鉻酸洗液浸泡24 h, 然后再徹底清洗, 晾干, 最后用干凈柔軟的棉巾將玻片擦凈晾干［1］。已用過的載玻片應(yīng)先浸泡于洗滌劑溶液中1～2 d, 或浸泡于煮沸的5%肥皂水1 h左右, 再移到新配置的洗滌劑溶液中1～2 h, 再用熱水將肥皂和血膜洗去, 用清水反復(fù)沖洗, 然后擦干或烤干備用［2］。

2 將血片分為6等份, 第1、2格貼標(biāo)簽及編號備用, 厚血膜涂在第3格中央, 薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部［3］。用推片的左下角, 從取血部位刮取4～5 μl血量, 使血滴與平置的載玻片接觸, 用推片的一角將血由內(nèi)向外旋轉(zhuǎn)2～4圈,涂成厚薄均勻, 直徑為0.8～1.0 cm左右的圓形厚血膜, 過厚易于脫落, 過薄達不到檢出率的要求。

制薄血膜時, 用推片一端邊緣的中點, 從取血部位取1～1.5 μl血量, 使血滴與平置的載玻片接觸, 待血液沿推片邊緣展開約2 cm長度時(玻片寬度為2.5 cm, 即兩邊稍留一點),使推片與載玻片呈30～45°, 均勻而迅速的輕輕從右向左推成舌狀薄膜, 制成的薄血膜應(yīng)在玻片上形成平鋪的血細(xì)胞,細(xì)胞之間互相接觸而不相互重疊, 每張載玻片上分別做1個薄血膜和1個厚血膜。至此, 1份完整的血檢瘧原蟲的血片制作完成。薄血膜中瘧原蟲形態(tài)完整, 被感染紅細(xì)胞未被破壞, 容易識別和鑒別蟲種, 但原蟲密度低時容易漏檢。厚血膜由于原蟲集中易檢獲, 檢出率是薄血膜的15～25倍, 但制片過程中紅細(xì)胞溶解, 原蟲形態(tài)有所改變, 蟲種鑒別較困難。

3 將制作好的血片放在陰涼干燥處自然晾干, 室溫大約在25～30℃左右, 干燥4 h左右后, 用甲醇固定薄血膜, 厚血膜端稍高于薄血膜端, 讓甲醇從薄血膜流下, 讓薄血膜自然晾干。甲醇固定完薄血膜后, 再對厚血膜進行溶血。用蒸餾水2～3滴, 均勻覆蓋在厚血膜上1～2 min, 滴蒸餾水時要輕輕的滴, 待厚血膜中央的紅色隨水晃動時, 輕輕沖洗去厚血膜上的蒸餾水, 待厚血膜自然干燥后染色。夏天標(biāo)本盡可能在24～48 h內(nèi)固定染色, 冬天也不能超過72 h。放置時間越久,血膜越不易溶血脫色, 染色效果也差。

4 吉氏染液的配置 取吉氏粉10 g, 甘油500 ml, 將吉姆薩粉10 g置于研缽中, 加入少量甘油小心充分研磨, 溶解緩慢,應(yīng)邊加邊磨, 至500 ml甘油加完研磨均勻為止。然后倒入1000 ml的容量瓶(或有塞玻璃瓶中)中［4］。每次加入少量甲醇至研缽中, 多次洗滌研缽中的殘留液, 至洗凈為止, 洗液均并入容量瓶中。最后加全部剩余甲醇正好稀釋至1000 ml刻度, 塞緊瓶塞, 充分搖勻, 置于55～60℃ 水浴中或溫箱內(nèi)24 h,或室溫內(nèi)3～5 d。期間經(jīng)常用力搖動此溶液幾分鐘。然后可儲存至玻璃瓶中塞緊備用。伊紅在水溶液中遇到美蘭或天青即可互相化合而產(chǎn)生沉淀, 從而失去染色能力, 因此, 吉氏母液絕對不能進水。

5 將染色儲備液(母液)加入蒸餾水作1:20～1:15稀釋(取吉氏母液1～2滴, 加中性蒸餾水10～30滴)混合均勻后, 將適量染液覆蓋厚薄血膜, 染色20～30 min, 輕輕漂洗掉染液即可。然后將染色后的玻片用清水沖洗干凈后, 將它放在陰涼干燥處晾干即可。至此, 一張完整的合格的血片制作完成［5］。

6 血片染色好壞除了玻片是否清潔, 血片制作質(zhì)量和染色技術(shù)等有關(guān)外, 還受到以下幾個因素的影響。

6.1 染料和溶劑的質(zhì)量以及染液的新舊。必須用分析純的甲醇和中性甘油, 而且配置時所用的器具必須干凈而無水分。如果試劑不純, 常使配置的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。新配置的染液染色效果較差, 染液存放時間越長, 染色力越強。盛放染液的瓶子應(yīng)加塞密閉, 以防吸潮而影響染液質(zhì)量。

6.2 染液的稀釋濃度及稀釋后使用時間。染液的濃度高,則著色快而深, 顏色常偏堿。染液濃度低, 則著色慢而淺,顏色偏酸。稀釋后的溶液必須當(dāng)時使用, 一般在30 min內(nèi)染色力最強。

經(jīng)過對發(fā)熱患者進行涂片鏡檢, 也得出了很多心得體會,對血片制作染色過程中的溫度、染液濃度、染色時間的長短、及染液濃度的配制和時間的相關(guān)性等方面的技巧有了一定的掌握。因此, 在全省的瘧疾防治工作中本縣具備了強有力的技術(shù)支持, 建立了健全的防瘧隊伍, 從而為早日實現(xiàn)中國消除瘧疾行動計劃中的目標(biāo)要求, 盡每一位醫(yī)務(wù)工作者最大的努力。

［1］ 于立勇, 魯玲, 周映兒.637例發(fā)熱病人瘧原蟲片復(fù)檢質(zhì)量分析.中國地方病防治雜志, 2014, 29(4):276-277.

［2］ 謝軼青, 鄒永根, 冷瑞珍, 等.血涂片檢查瘧原蟲的質(zhì)量評價.中國熱帶醫(yī)學(xué), 2004, 4(5):760-761.

［3］ 張小萍, 金小林, 高琪, 等.江蘇省不同地區(qū)的瘧疾監(jiān)測.中國寄生蟲防治雜志, 2001, 14(2):84-86.

［4］ 吳英松, 李明, 董文其, 等.惡性瘧原蟲乳酸脫氫酶的表達及免疫活性鑒定.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2001, 19(2):80-83.

［5］ 李錦輝, 黃亞銘, 郭傳坤, 等.廣西三個虐區(qū)縣(市)抗瘧措施質(zhì)量與效果調(diào)查.中國熱帶醫(yī)學(xué), 2007, 7(4):590-592.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.22.194

2015-01-12］

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