陳受琳 陳 勇 華福洲 吳清華

炎癥反應過程中，中性粒細胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)是機體非特異免疫中最重要的效應細胞［1］。中性粒細胞激活后通過呼吸爆發(fā)，釋放活性氧(reactive oxygen species，ROS)來防御外來病原體入侵，細胞凋亡是機體適應炎性反應的調控過程。免疫功能低下的群體，較多地存在于全身情況差的手術病人及ICU 病人，右美托咪啶和丙泊酚，是手術術中及術后ICU 病人長期鎮(zhèn)靜最常使用的麻醉藥物［2］。本實驗將研究這兩種麻醉藥對PMN 釋放ROS 及對細胞凋亡的干預作用。

1 資料與方法

1.1 材料與方法

主要試劑與儀器:二氫羅丹明123(dihydrorhodamine 123，DRH)、佛波酯(phorbol 12 - myristate 13 - acetae，PMA)、右美托咪啶(dexmedetomidine;批號H20090248)、丙泊酚(propofol，AstraZeneca，批號:H20130504)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)、Annexin V -FITC 凋亡檢測試劑盒、Arial III +Calibur 流式細胞儀、SC -2556 型離心機等。

1.2 方法

1.2.1 研究分組 分為空白對照組(C)，右美托咪啶組(D)，丙泊酚組(P)。其中D 組分為D1、D2、D3 三個亞組(終濃度分別為0.5、5、50 ng/ml)，P 組分為P1、P2、P3 三個亞組(終濃度分別為5、50、500 μg/ml)。分別相當于二者臨床麻醉時血藥濃度的1、10 和100 倍［3-4］。

1.2.2 標本采集 健康志愿者8 名，年齡20 ～40 歲，體重55 ～75 kg，無吸煙史，無感染及免疫系統(tǒng)疾病、近2 周內未服用影響免疫功能的藥物。以肝素化試管抽取空腹肘靜脈血20 ml。

1.2.3 技術方法 測定PMN 的ROS 釋放。實驗方法參考文獻［5］，各試管中均加入抗凝全血100ul/管，再分別加入右美托咪啶、丙泊酚，使其終濃度達到各自預定值。C 組試管加等體積PBS(0.01 M，pH 7.2)，均作復管。37 ℃水浴箱孵育30 分鐘后加入DHR(終濃度15 nmol/L)，孵育10 min，加PMA(終濃度0.15 umol/L)，孵育20 min。加入紅細胞裂解液2 ml，裂解RBC，混勻，避光室溫下靜置20 min，3 000 rpm離心5 min，棄上清液并加入含1%多聚甲醛的PBS (0.01 M，pH 7.2)0.5 ml 懸浮細胞，混勻，3 000 rpm 再次離心5 min，棄上清液加入PBS 重懸浮。陰性對照管調零，流式細胞儀上單通道檢測平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)，取復管的均值作為ROS 強度的測定值。

1.2.4 檢測PMN 凋亡 每組取重懸的細胞懸液100 μl，加入Annexin V-FITC 5 μl 和碘化丙錠溶液10 μl，混勻室溫避光孵育15 min，加入PBS 重懸細胞溶液300 μl。流式細胞儀上檢測平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)，通過觀測細胞變化及亞二倍體峰出現(xiàn)確定細胞凋亡百分比。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)± 標準差(±s)表示，組間比較采用秩和檢驗，p ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對PMN 釋放ROS 的影響 與C 組相比，P1 組無統(tǒng)計學差異，其余各組均顯著低于對照組(p ＜0.05);與P 組相比，D1、D2、D3 組顯著低于相當藥物濃度的P1、P2、P3 組(p ＜0.05)。提示兩者均劑量依賴性地抑制PMA 刺激后PMN ROS 的釋放。臨床濃度的右美托咪啶對PMN OS 釋放有抑制作用，而丙泊酚對PMN ROS 釋放影響輕微;在相當?shù)乃幬餄舛葧r，右美托咪啶抑制作用強于丙泊酚。提示兩種藥物干預后，均明顯減弱中性粒細胞的呼吸爆發(fā)功能，右美托咪啶的作用強于丙泊酚。

2.2 對PMN 凋亡率的影響 與C 組相比，D 組內各組均顯著低于C 組，P 組內P3 與C 組差異顯著，其余兩組不明顯;與P 組相比，D 組內D1、D2 組顯著低于相當藥物濃度的P1、P2 組(p ＜0.05)，D3 組與P3 組差異不顯著。提示不同濃度的右美托咪啶均降低細胞凋亡率，高濃度的丙泊酚也有降低細胞凋亡率的作用。

表1 各組樣本對PMA 刺激后PMN 功能比較 (n=10，±s)

表1 各組樣本對PMA 刺激后PMN 功能比較 (n=10，±s)

與空白組比較，1)p ＜0.05;與丙泊酚組比較，2)p ＜0.05

組別濃度(ng/ml)平均熒光強度凋亡率(%)對照組——890.3 ±15.652% ±9%D 組D1:0.5701.5 ±50.21)2) 38 ±61)2)D2:5465.1 ±55.81)2) 26 ±121)2)D3:50304.9 ±14.11)2) 24 ±61)P 組P1:5878.5 ±51.250 ±11 P2:50610.6 ±62.21)47 ±8 P3:500568.4 ±55.21)27 ±71)

3 討論

當PMN 在吞噬異物或受刺激活化時，產生大量的ROS ，ROS 具有很高的反應性，可以與細菌的細胞膜、核酸分子及蛋白質發(fā)生氧化還原反應，造成微生物的損傷和死亡［6］。此外，ROS 還可上調一些細胞因子及粘附分子如TNF -a、IL -1、ICAM-1 的表達水平［7］，放大炎癥效應，這一過程又稱呼吸爆發(fā)。ROS 的釋放能促進病原微生物的清除、促進傷口愈合。但在某些病理條件下，如嚴重創(chuàng)傷、燒傷、感染，ROS 的過度釋放是導致全身炎癥反應綜合征、多器官功能障礙的重要原因［8］，抑制ROS 的釋放有助于控制炎癥。此外，ROS 正常發(fā)揮其功能與PMN 的正常細胞凋亡密切相關。創(chuàng)傷、感染條件下，PMN 的凋亡延遲，延長了PMN 的作用時間，增加了ROS 的釋放。

丙泊酚是臨床上使用最廣泛的經(jīng)典靜脈麻醉藥。而右美托咪啶是新型高選擇性α2 腎上腺素能受體激動劑［9］，具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抑制交感活性等作用，有取代丙泊酚或減少丙泊酚用量的趨勢。兩者均是術中及術后ICU 病人最常使用的鎮(zhèn)靜藥物。本研究顯示:右美托咪啶和丙泊酚均明顯減弱中性粒細胞的呼吸爆發(fā)功能，具有抗氧化的作用。不同濃度的右美托咪啶及高濃度的丙泊酚有抑制PMN 凋亡的作用，這在控制全身過度炎癥反應上是非常有意義的。有報道顯示丙泊酚的抗炎作用可能與白介素6 有關［10］，而右美托咪啶的抗炎作用機制尚需進一步研究。在本次研究中，通過選取5 份健康成人并采集其外周靜脈血，其中對照組(C 組)，右美托咪啶1、2、3 組(D1、D2、D3 組)，終濃度分別為0.5、5、50 ng/ml，丙泊酚1、2、3 組(P1、P2、P3 組)，終濃度分別為5、50、500 μg/ml，分別加入DHR 標記。經(jīng)分析可知，提示兩種藥物干預后，均明顯減弱中性粒細胞的呼吸爆發(fā)功能，右美托咪啶的作用強于丙泊酚。由此可見右美托咪定可對中性粒細胞呼吸爆發(fā)功能發(fā)揮更為有效的抑制作用。研究結果同時顯示，與C 組相比，D 組內各組均顯著低于C 組，P 組內P3 與C 組差異顯著，其余兩組不明顯;與P 組相比，D 組內D1、D2 組顯著低于相當藥物濃度的P1、P2 組(p ＜0.05)，從這一結果可以看出，不同濃度的右美托咪啶均降低細胞凋亡率，高濃度的丙泊酚也有降低細胞凋亡率的作用。

綜上所述，右美托咪啶和高濃度的丙泊酚具有抑制ROS 釋放，抗氧化的作用和抑制PMN 凋亡的作用，研究麻醉藥物對PMN 激活后的干預作用有助于指導合理的麻醉用藥，改善術后感染的發(fā)生率。

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