檀巧婷，嚴佳，周欣，宋洪濤

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科，福州 350025)

4種糖漿劑微生物限度檢查方法的建立*

檀巧婷，嚴佳，周欣，宋洪濤

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科，福州 350025)

目的建立氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿、鹽酸苯海拉明糖漿和馬來酸氯苯那敏糖漿的微生物限度檢查方法。方法采用2010年版《中華人民共和國藥典》微生物限度檢查的常規(guī)法、培養(yǎng)液稀釋法對4種糖漿進行5種菌的微生物限度檢查及方法學驗證。進行試驗的每種糖漿劑均分為試驗組、菌液組、供試品對照組及稀釋劑對照組。結果4種糖漿劑采用常規(guī)法時，氯化銨糖漿5種菌的回收率為72.0%～85.5%；硫酸亞鐵糖漿77.3%～88.5%；鹽酸苯海拉明糖漿78.2%～90.1%，僅有馬來酸氯苯那敏糖漿對5種試驗菌株的回收率為37.4%～52.7%，低于70%，證明其有抑菌作用，而采用培養(yǎng)液稀釋法后，回收率為80.3%～92.7%，微生物限度檢查結果符合要求。結論氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿和鹽酸苯海拉明糖漿微生物限度檢查可采用常規(guī)法，而馬來酸氯苯那敏糖漿采用培養(yǎng)液稀釋法；控制菌檢查均可按照常規(guī)法進行。

糖漿劑；微生物限度；稀釋法，培養(yǎng)液

糖漿是指含藥物的濃蔗糖溶液，含蔗糖量不低于45%(g·mL-1)[1]。糖漿含有高濃度的糖，多食傷脾，糖尿病患者也不宜服用，但由于其能掩蓋某些藥物的苦味、咸味及其他不適臭味，容易服用，臨床療效明顯，尤其受兒童歡迎，因而受到廣泛應用。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版規(guī)定，糖漿劑需進行微生物限度檢查。結合總后勤部衛(wèi)生部開展的軍隊醫(yī)療制劑標準提高計劃，筆者通過實驗，確定了氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿、鹽酸苯海拉明糖漿和馬來酸氯苯那敏糖漿的微生物限度檢查方法，并結合其處方組成，探討4種糖漿劑成分與微生物限度檢查方法的相關性。

1 儀器與材料

1.1 儀器和設備 GHP-9160型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一橫科技有限公司)、SW-CJ-1B型凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)、MJPS-150型真菌培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)、LDZX-40KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.2 試驗菌種 試驗用菌分別是：白念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]、金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、大腸埃希菌 [CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌 [CMCC(F)10104]，均由福建省食品藥品檢驗所提供。

1.3 培養(yǎng)液及稀釋液 本次試驗所用到的改良馬丁培養(yǎng)液(批號：1211282)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)液(批號： 130910)、膽鹽乳糖培養(yǎng)液(批號：1204192)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)液(批號：111201)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液(批號：120417)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液(批號：120601)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)液(批號：130221)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)液(批號：131124)和pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：120329)均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

1.4 樣品 氯化銨糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號：131203)，硫酸亞鐵糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號：131203)，鹽酸苯海拉明糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號：131216)，馬來酸氯苯那敏糖漿(規(guī)格：每瓶100 mL，批號：131216)，均由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學科制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備、計數(shù)及菌液稀釋度的確定

2.1.1 細菌菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至9 mL營養(yǎng)肉湯中，35 ℃培養(yǎng)24 h，制得菌懸液。取菌懸液1 mL用0.9%無菌氯化鈉溶液依次10倍稀釋至10-7，制成含菌數(shù)為50～100 cfu·mL-1的菌懸液[2-6]。

2.1.2 真菌菌液制備 接種白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，制得白念珠菌菌懸液，取菌懸液1 mL，加至0.9%無菌氯化鈉溶液，依次作10倍稀釋至10-7，制成含菌數(shù)為50～100 cfu·mL-1的菌懸液。取黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液(含0.05%聚山梨酯80)，洗脫孢子，吸出孢子懸液至無菌試管，取菌懸液1 mL，加至9 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液(含0.05%聚山梨酯80)，依次稀釋至10-7，制成含孢子數(shù)為50～100 cfu·mL-1的孢子懸液[2-6]。

2.2 供試液制備 分別精密量取4種糖漿劑各10 mL，加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，制成1：10的供試液備用[2-6]。

2.3 回收率測定

2.3.1 常規(guī)法測定 試驗組：分別取1：10的供試液1 mL和上述制備好的50～100 cfu·mL-1的試驗菌液置無菌平皿中，加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液及玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)液，混合均勻，放置凝固后倒置培養(yǎng)，每株試驗菌分別制備2個平皿，按規(guī)定培養(yǎng)條件培養(yǎng)，逐日觀察結果，記錄菌落數(shù)。菌液組：取等體積的上述50～100 cfu·mL-1試驗菌液，同試驗組操作。供試品對照組：不加菌液，同試驗組操作，測定供試品菌數(shù)。稀釋劑對照組：取稀釋液1 mL和50～100 cfu·mL-1的試驗菌液，同試驗組操作。回收率見表1。氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿和鹽酸苯海拉明糖漿回收率均>70%，可采用常規(guī)法，而馬來酸氯苯那敏糖漿回收率小于70%，對5種菌株均有抑菌作用，應重新建立新的方法并驗證。

表1 常規(guī)法驗證試驗回收率 %，n=3

樣品大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白念珠菌黑曲霉氯化銨糖漿77．872．080．577．185．5硫酸亞鐵糖漿81．277．386．488．582．1鹽酸苯海拉明糖漿86．778．290．180．484．0馬來酸氯苯那敏糖漿50．344．847．137．452．7

2.3.2 培養(yǎng)液稀釋法 試驗組：取50～100 cfu·mL-1的試驗菌液和“2.2”項下的馬來酸氯苯那敏糖漿供試液0.2 mL，分別加入10個無菌平皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)液及玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)液，混合均勻，放置凝固后倒置培養(yǎng)，每株試驗菌分別制備10個平皿，培養(yǎng)，逐日觀察結果，記錄菌落數(shù)。菌液組、供試品對照組、稀釋劑對照組同“2.3.1”操作。測定菌落數(shù)，計算回收率。結果大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉回收率依次為80.3%，84.8%，90.1%，89.4%，92.7%(n=3)。故采用培養(yǎng)液稀釋法后，馬來酸氯苯那敏糖漿回收率>70%，符合要求。

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 大腸埃希菌方法驗證 試驗組：取制備好的供試液10 mL及10～100 cfu·mL-1的大腸埃希菌菌液接種至100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液0.2 mL，接種至4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)液5 mL管內培養(yǎng)，分別于5，24 h置366 nm紫外燈下，觀察后，沿管壁加入靛基質試液數(shù)滴，觀察有無玫瑰紅色產生。供試品對照組：取同等體積供試液，同試驗組操作。陽性對照組：按試驗組的方法操作，不加供試液。陰性對照組：取稀釋液10 mL按試驗組方法操作，不加菌液。

2.4.2 驗證試驗結果 試驗組、陽性對照組檢出大腸埃希菌，陰性對照組、供試品對照組未檢出大腸埃希菌。4種供試品的控制菌檢測方法可以按常規(guī)法檢驗。結果見表2。

表2 控制菌檢查方法驗證

+：檢出細菌；-：未檢出細菌

3 討論

氯化銨糖漿、硫酸亞鐵糖漿和鹽酸苯海拉明糖漿蔗糖濃度分別為62.6%，82.5%，72.2%，3種糖漿雖含糖濃度不同，但菌落生長無明顯差異，均采用常規(guī)法進行微生物限度檢查。糖漿含量在62%～82%范圍內微生物的生長與糖漿含量可能關系不大。也有文獻報道糖漿劑蔗糖含量在60%以內，微生物的生長與糖漿劑蔗糖含量關系不大。糖漿的霉變、發(fā)酵與糖漿在生產過程中的衛(wèi)生條件、防腐措施、成品消毒和儲藏條件等因素有關[7]。

馬來酸氯苯那敏糖漿蔗糖濃度為68.0%，采用培養(yǎng)液稀釋法進行微生物限度檢查，可能為處方中含有7%乙醇，增加其抑菌作用，采用常規(guī)法不能消除其抑菌性[8-13]。糖漿中的乙醇含量與微生物驗證方法的關系，還有待進一步考察。

本實驗通過對4種糖漿劑微生物限度檢查方法的研究，可見糖漿的微生物限度檢查方法與其處方組成有關。因此，微生物限度檢查方法并不是單純與藥品劑型相關，當樣品成分、制劑生產工藝等條件發(fā)生改變時檢驗方法都需要重新驗證。

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2014-10-23

2015-01-02

*軍隊醫(yī)療機構制劑標準提高科研專項重點課題(13ZJ01)

檀巧婷(1984-)，女，福建福州人，藥師，學士，研究方向：藥物分析。電話：0591-22859963，E-mail：tqt-010@163.com。

宋洪濤(1968-)，男，山東肥城人，主任藥師，博士，博士生導師，研究方向：藥物新劑型和制劑新技術，藥物基因組學與個體化給藥研究。電話：0591-22859459，E-mail：sohoto@vip.163.com。

R944.1；R969.3

B

1004-0781(2015)12-1652-03

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.026