涂睿，劉孝橋

(1.三峽大學第三臨床醫(yī)學院，宜昌 443000；2.湖北省宜昌市葛洲壩中心醫(yī)院腫瘤科，宜昌 430071；3.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院兒科，宜昌 443003)

白藜蘆醇對人腎細胞癌786-0細胞存活素及p27蛋白表達的影響

涂睿1，2，劉孝橋3

(1.三峽大學第三臨床醫(yī)學院，宜昌 443000；2.湖北省宜昌市葛洲壩中心醫(yī)院腫瘤科，宜昌 430071；3.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院兒科，宜昌 443003)

目的探討白藜蘆醇(Res)對人腎細胞癌細胞存活素、p27蛋白表達的影響。方法使用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)作用人腎細胞癌786-0 細胞12，24及48 h后，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測786-0細胞周期和凋亡情況，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測細胞存活素、p27蛋白的表達情況，以空白培養(yǎng)液作為對照組。結(jié)果實驗組G1期[(64.87±3.76)%]及G2期[(9.91±0.82)%]比例顯著性降低(P<0.05)，S期[(25.05±3.12)%]比例顯著性升高(P<0.05)；實驗組在12，24和48 h等不同時間點的細胞凋亡率[(5.12±0.64)%，(5.71±0.49)%，(5.84±0.30)%]均明顯高于對照組[(0.72±0.27)%，(0.93±0.25)%，(1.12±0.21)%，P<0.05]；實驗組存活素蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達呈顯著性升高(P<0.05)；實驗組p27蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達水平呈顯著性降低(P<0.05)；實驗組細胞存活素與p27蛋白表達之間呈負相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)。結(jié)論Res通過抑制p27蛋白的表達而上調(diào)存活素的表達水平，進而促進腎細胞癌786-0細胞的凋亡。

白藜蘆醇；癌，腎細胞；存活素；p27蛋白

白藜蘆醇(reservatrol，Res)是提取自葡萄、花生和虎杖等植物的酚類化合物，其不僅具有抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激及保護神經(jīng)細胞等藥理作用，而且還對包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤疾病具有治療作用[1-2]。存活素是一種凋亡抑制基因(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，與細胞凋亡和周期均有密切的聯(lián)系。p27則為一種抑癌基因，其蛋白在細胞周期和凋亡過程中均有所參與，對細胞周期具有明顯的負性調(diào)控作用。流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，腎細胞癌是常見于泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤疾病，故本研究擬探討Res對人腎細胞癌786-0細胞存活素、p27蛋白表達的影響，為其在腎細胞癌的臨床治療應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人腎細胞癌786-0細胞株購自上海細胞生物學研究所。

1.2 試劑及儀器 Res購自美國Sigma公司；存活素、p27單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)購自上海恒遠生物科技有限公司。流式細胞儀為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品；RDY-ZY2型轉(zhuǎn)印電泳儀購自上海歐翔科學儀器有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)方法 人腎細胞癌786-0細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)液(內(nèi)含20%胎牛血清，1×105U·L-1青霉素、鏈霉素)，在37 ℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱里進行培養(yǎng)。

1.4 細胞周期檢測方法 取處于對數(shù)生長期的人腎細胞癌786-0細胞，用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)培養(yǎng)處理24 h，以DMEM培養(yǎng)液作為對照組，每組需設(shè)置3個實驗復(fù)孔。離心處理后收集1×106·mL-1細胞，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌后，使用PI復(fù)合染液在避光位置染色處理20 min，采用流式細胞儀對各組細胞周期予以檢測，用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

1.5 細胞凋亡檢測方法 取處于對數(shù)生長期的人腎細胞癌786-0細胞，用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)培養(yǎng)處理12，24和48 h，每組需設(shè)置3個復(fù)孔。4 ℃條件下2 000 r·min-1(r=6 cm)離心處理后收集1×106·mL-1細胞，加入Annexin-V-FITC試劑在4 ℃條件下進行反應(yīng)，加入PI復(fù)合染液10 μL，用流式細胞儀對細胞凋亡進行分析。

1.6 存活素、p27蛋白表達檢測方法 采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測各組細胞存活素、p27蛋白表達水平，在94 ℃溫度條件下加熱處理10 min，然后使用分離膠對組織樣品予以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)電泳，從凝膠組織中將蛋白質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至濾膜上，電泳轉(zhuǎn)印處理后行Western blot檢測，一抗以1：200予以稀釋處理，二抗則以1：750予以稀釋處理，采用二氨基聯(lián)苯胺染色(3,3'-diaminobenzidine,DAB)試劑盒顯色處理，如有蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)立即用大量PBS溶液沖洗以終止Western blot反應(yīng)過程，實驗結(jié)果采用專用掃描儀器分析和處理，其中存活素為16 000，p27蛋白為27 000，目的蛋白/GAPDH的灰度比值表示其蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 Res對人腎細胞癌786-0細胞周期的影響 用Res培養(yǎng)液(25 μmol·L-1)培養(yǎng)處理人腎細胞癌786-0細胞24 h后，實驗組G1期及G2期比例顯著性降低(P<0.05)，S期比例顯著性升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組人腎細胞癌786-0細胞周期的比較

Tab.1 Comparison of cell cycle between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells

組別G1期S期G2期對照組75．42±4．3413．22±2．0811．30±1．33實驗組64．87±3．76?125．05±3．12?19．91±0．82?1

與對照組比較，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

2.2 Res處理不同時間對人腎細胞癌786-0細胞凋亡的影響 實驗組在12，24和48 h等不同時間點的細胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 兩組不同時間點人腎細胞癌786-0細胞凋亡率的比較

Tab.2 Comparison of apoptosis between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

組別12h24h48h對照組0．72±0．270．93±0．251．12±0．21實驗組5．12±0．64?15．71±0．49?15．84±0．30?1

與對照組比較，*1P<0.05

Compared with control group，*1P<0.05

2.3 Res處理不同時間對人腎細胞癌786-0細胞存活素、p27蛋白表達的影響 實驗組存活素蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達呈顯著性升高(P<0.05)；實驗組p27蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，且隨時間延長表達水平呈顯著性降低(P<0.05)。見表3，圖2。

2.4 存活素、p27蛋白表達的相關(guān)性分析 實驗組細胞存活素與p27蛋白表達之間呈負相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)。

3 討論

Res是植物受到某些因素侵害時產(chǎn)生的一種抗毒

圖1 兩組人腎細胞癌786-0細胞不同時間點凋亡流式細胞圖

表3 兩組不同時間點人腎細胞癌786-0細胞存活素、p27蛋白表達的比較

Tab.3 Comparison of the expression of survivin and p27 protein between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

組別與時間例數(shù)存活素/GAPDHp27/GAPDH對照組30 12h0．57±0．110．87±0．21 24h0．55±0．130．85±0．22 48h0．59±0．150．88±0．24實驗組27 12h0．74±0．17?10．65±0．12?1 24h0．97±0．21?1?20．51±0．08?1?2 48h1．21±0．24?1?20．42±0．07?1?2

與對照組同時間點比較，*1P<0.05；與本組前一時間點比較，*2P<0.05

Compared with control group at same time point，*1P<0.05；compared with same group at former time point，*2P<0.05

素，其藥理作用十分廣泛，除已知多種藥理作用外，還有較多實驗研究發(fā)現(xiàn)，Res對腎細胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等均有明顯的治療作用，但作用機制仍未研究清楚[3]。目前主要認為Res通過對腫瘤細胞的增殖過程加以抑制，進而使得細胞周期表現(xiàn)出明顯的易變性。國內(nèi)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腎細胞癌細胞G0/G1期細胞的比例顯著升高，而S期細胞比例明顯降低，最終腫瘤細胞在G1期停止[4-5]。國外實驗研究則發(fā)現(xiàn)，Res可促進細胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制蛋白WAF1/p21的表達水平，使得癌細胞在S期停止[6]。本研究采用流式細胞儀對細胞周期進行檢測，結(jié)果顯示G1期及G2期細胞比例顯著性降低，而S期細胞比例明顯升高，與上述結(jié)果相符，且細胞凋亡率明顯高于對照組，由此可知Res將786-0細胞阻滯在S期，并且誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

圖2 兩組不同時間點人腎細胞癌786-0細胞存活素、p27蛋白的表達

Fig.2 Comparison of the expression of survivin and p27 protein between two groups of human renal carcinoma 786-0 cells at different time points

存活素蛋白是一種IAP家族新成員，在腫瘤組織中存活素均呈異常的高表達水平，且與腫瘤疾病的預(yù)后情況有著密切的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，其不但能抑制細胞的凋亡現(xiàn)象，還能對細胞的有絲分裂過程予以調(diào)節(jié)，通過抑制Caspase-3、Caspase-7的生物學活性作用對細胞的凋亡現(xiàn)象加以抑制，存活素表達水平增高可協(xié)助克服G2/M期檢測點，通過有絲分裂這種方式促進細胞的增殖過程[7-8]。p27蛋白對細胞周期具有負性調(diào)節(jié)和控制作用，主要通過抑制CDK的生物學活性作用，使得細胞在G1期出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，抑制其進入S期，進而對細胞的增殖過程加以抑制，使得細胞有時機去修復(fù)已受到嚴重損傷的DNA[9]。p27蛋白表達水平下降則會減低其對CDK生物學活性作用的抑制效應(yīng)，細胞得以順利完成細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)化過程，細胞增殖速度明顯增快，促進腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程。

本研究結(jié)果顯示，實驗組存活素或p27蛋白表達水平明顯高(或低)于對照組，且隨時間延長表達呈顯著性升高(或降低)，且存活素與p27蛋白表達之間呈負相關(guān)性關(guān)系，此結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究相符，證實存活素蛋白高表達和p27蛋白低表達與腎癌的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)性[10-11]。存活素蛋白表達的異常使得細胞凋亡抑制作用失去正?？刂疲瑫rp27蛋白表達水平降低，使得細胞增殖能力明顯加強，兩者共同發(fā)揮作用，促進腫瘤細胞和組織的發(fā)生及發(fā)展過程[10]。此外存活素具有細胞周期依賴性表達的生理學特性，主要在G2/M期表達，而p27能使細胞產(chǎn)生G1期阻滯，導(dǎo)致存活素表達水平明顯下降，這可能是p27下調(diào)存活素表達的主要原因[12]。由此推測，Res可通過抑制p27蛋白的表達水平而上調(diào)存活素的表達水平，進而促進腎細胞癌786-0細胞的凋亡。

[1] QUINCOZES-SANTOS A，GOTTFRIED C.Reservatrol mod-ulates astroglial functions：neuroprotective hypothesis[J].Ann NY Acad Sci，2011，1215：72-78.

[2] SHUKLA Y，SINGH R.Reservatrol and cellular mechanisms of cancer prevention[J].Ann NY Acad Sci，2011，1215：1-8.

[3] LIN H Y，TANG H Y，SHIH A，et al.Thyroid hormone is a MAPK-dependent growth factor for thyroid cancer cells and is anti-apoptotic[J].Steroids，2007，72(2)：180-187.

[4] 宮大鑫，何舜發(fā)，孫志熙，等.Survivin在腎癌組織和腎癌細胞系中的表達及意義[J].中國醫(yī)科大學學報，2008，37(1)：116-118.

[5] 焉杰克，徐忠華，王洪偉，等.凋亡抑制因子Survivin在腎癌中的表達及意義[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志，2007，12(5)：284-286.

[6] SHI T，LIOU L S，SADHUKHAN P，et al.Effects of reser-vatrol on gene expression in renal cell carcinoma[J].Cancer Biol Ther，2004，3(9)：882-888.

[7] LING X，LI F.Silencing of an tiapoptotic survivin gene by multiple approaches of RNA interference technology[J].Biotechniques，2004，36(3)：450-454，456-460.

[8] YANG D，WELM A，BISHOP J M，et al.Cell division and cell survival in the absence of survivin[J].Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(42)：15100-15105.

[9]MIGITA T，ODA Y，NAITO S，et al.Low expression of p27kiplis associated with tumor size and poor prognosis in patients with renal cell carcinoma[J].Cancer，2002，94(4)：973-979.

[10] 盧建林.腫瘤標志物Survivin及p27蛋白在腎細胞癌中表達的臨床意義[J].放射免疫學雜志，2009，22(5)：535-537.

[11] ANDERSEN M H，THOR S P.Survivin：a universal tumor antigen[J].Histol Histopathol，2002，17(2)：669-675.

[12] 張靜，劉存.p27、Survivin在乳腺癌中的表達及相關(guān)性[J].新疆醫(yī)科大學學報，2006，29(6)：477-479.

Effect of Resveratrol on the Expression of Survivin and p27 Protein in Human Renal Cell Carcinoma 786-0 Cells

TU Rui1, 2, LIU Xiaoqiao3

(1.NO.3ClinicMedicineSchool,SanxiaUniversity,Yichang443000,China； 2.DepartmentofOncology,theCenterHospitalofGezhoubainYichang,Yichang430071,China； 3.DepartmentofPediatrics,theCenterPeople'sHospitalofYichang,Yichang443003,China)

Objective To investigate the effect of resveratrol (Res) on the expression of survivin, p27 protein in human renal cell carcinoma 786-0 cells. Methods The cell cycle and apoptosis of 786-0 cells were detected by flow cytometry, and the expression of survivin and p27 protein of 786-0 cells was detected by Western blotting at time point of 12, 24 and 48 h after human renal cell carcinoma 786-0 cells were cultured with Res (25 μmol·L-1) and blank medium, respectively. Results The ratio in G1phase [(64.87±3.76)%] and G2phase [(9.91±0.82)%] in the experimental group decreased significantly (P<0.05), and the ratio of S phase [(25.05±3.12)%] increased significantly (P<0.05).The apoptosis rate of experimental group at 12, 24 and 48 h [(5.12±0.64)%, (5.71±0.49)%, (5.84±0.30)%] was significantly higher than that of the control group [(0.72±0.27)%, (0.93±0.25)%, (1.12±0.21)%,P<0.05].The expression of survivin protein in experimental group was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the expression was significantly increased with time prolonging (P<0.05).The expression of p27 protein in experimental group was significantly lower than that of the control group (P<0.05), and the expression level was significantly decreased in time-dependent manner (P<0.05).There was a negative correlation between the expression of survivin and p27 protein in the experimental group (P<0.05). Conclusion Res could inhibit the expression of p27 protein and up-regulate survivin expression level, and promote the apoptosis of renal cell carcinoma 786-0 cells.

Resveratrol； Carcinoma, renal cell； Survivin； p27 protein

2014-12-06

2015-01-23

涂睿(1982-)，男，湖北宜昌人，在讀碩士，研究方向：腫瘤疾病診斷與治療。電話：(0)13477122493，E-mail：turuiyc@126.com。

R285.5；R739.9

A

1004-0781(2015)12-1572-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.006