曹 靜，王云杰，李俊生（. 臨沂市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東 臨沂76003；. 臨沂經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)人民醫(yī)院，山東 臨沂7603）

異源三聚體鳥(niǎo)苷酸調(diào)節(jié)蛋白（G 蛋白）信號(hào)通路在正常肝組織生長(zhǎng)和再生中起著重要作用[1]，而在肝癌組織中G 蛋白的表達(dá)和功能均失常[2]。鑒于G 蛋白的表達(dá)和功能對(duì)正常肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞均有十分重要的作用，作者設(shè)想G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（regulator of G protein signalling，RGS）在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌形成的過(guò)程中可能也起著同樣重要的作用。2013 年1～10 月，作者從體外細(xì)胞株和裸鼠體內(nèi)2 個(gè)層面觀察了RGS17 在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株的表達(dá)，探討其在肝細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動(dòng)物 肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH7 及正常肝細(xì)胞株THLE-2（上海交通大學(xué)上海市腫瘤研究所惠贈(zèng)）；無(wú)特定病原體（SPF）4 周齡雄性裸鼠10 只[購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物中心，批號(hào)SCXK（滬）2012-0002]。

1.1.2 主要試劑與儀器

1.1.2.1 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司原裝進(jìn)口）和DMEM 培養(yǎng)基（杜氏改良培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）兩步法試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄酶（日本Takara 公司產(chǎn)品）；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品）；引物（上海生工有限公司合成）；焦磷酸二乙酯（DEPC）水（購(gòu)自杭州碧云天公司）；氯仿（購(gòu)自Sigma 公司）；異丙醇（購(gòu)自德國(guó)Merck 公司）；抽提RNA 用無(wú)RNA 酶EP 管和real-time-PCR 管（購(gòu)自美國(guó)Axygen 公司）；CCK-8 試劑（日本同仁公司生產(chǎn)，原裝進(jìn)口）。

1.1.2.2 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)皿和96 孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning 公司）；5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和處理細(xì)胞用超凈工作臺(tái)（EQR/GL-65，美國(guó)Thermo 公司生產(chǎn)）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)）；real-time-PCR 儀（美國(guó)ABI 公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH7 及正常肝細(xì)胞株THLE-2 用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液及10%胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入青霉素（100 μg/mL）和鏈霉素（50 μg/mL）以防止細(xì)胞污染。細(xì)胞在37 ℃、5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（時(shí)間不固定，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至少2 d 以上）。細(xì)胞換液、傳代、凍存等操作均在無(wú)菌細(xì)胞超凈工作臺(tái)進(jìn)行。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%覆蓋時(shí)傳代，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，再用2.5%胰酶0.5 mL 消化，鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓時(shí)棄去胰酶溶液，用含10%胎牛血清培養(yǎng)基吹打，將1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿的細(xì)胞傳入3 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿備用。

1.2.2 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，鋪入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約2 000 個(gè)細(xì)胞。從鋪板第2 天起檢測(cè)細(xì)胞活性，每天1次。檢測(cè)時(shí)將孔中培養(yǎng)基吸凈，加入用培養(yǎng)基配成的10%CCK-8檢測(cè)試劑，37 ℃放置1.5 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)其光密度（OD）值，間接反映細(xì)胞活性。

1.2.3 動(dòng)物皮下移植成瘤模型的建立 取SPF 4 周齡雄性裸鼠10 只，采用自身對(duì)照試驗(yàn)，在裸鼠皮下接種肝癌細(xì)胞株HuH7，成瘤后檢測(cè)瘤組織（模型組）和肝組織（對(duì)照組）中RGS17 mRNA 的表達(dá)差異。具體方法如下。

1.2.3.1 模型組 擴(kuò)增培養(yǎng)HuH7 細(xì)胞，從6 cm 培養(yǎng)皿傳入10 cm培養(yǎng)皿，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到2×107個(gè)；消化細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，用不加胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至1×104μL-1，置于冰上；用1 mL 注射器將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液200 μL 皮下注射于裸鼠左側(cè)腹股溝處，每3 天觀察成瘤情況；成瘤后28 d 取瘤時(shí)，將裸鼠用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，用組織剪剪開(kāi)裸鼠皮膚，用鑷子及眼科剪協(xié)助將腫瘤組織從皮下完整剝離切除，稱質(zhì)量后放入PBS中等待裂解提取總RNA。

1.2.3.2 對(duì)照組 將裸鼠用戊巴比妥鈉麻醉，組織剪小心剪開(kāi)其皮膚，用鑷子夾起胸骨，剪開(kāi)腹部肌肉暴露腹腔，將肝臟完全切除，放入PBS 中等待裂解提取RNA。

1.2.4 總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄 將1.2.1 中培養(yǎng)的3 種細(xì)胞和1.2.3 中移植的瘤塊組織（每塊1 g）用PBS 沖洗，對(duì)瘤塊組織和肝組織抽提的RNA，應(yīng)先用勻漿器勻漿，加入1 mL Trizol 試劑，反復(fù)吹打消化后，加入200 μL 氯仿，振蕩混勻15 s，室溫靜置3 min，然后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。微量移液器吸取上清液放入新的無(wú)RNA 酶的1.5 mL EP 管中。每管加500 μL 預(yù)先冰上冷凍的異丙醇，-20 ℃沉淀0.5 h，然后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。離心后可見(jiàn)管底有白色RNA 沉淀，用DEPC 水配制的75%無(wú)水乙醇洗一遍后晾干，用50 μL DEPC 水溶解RNA 備用。取1 μL 作為逆轉(zhuǎn)錄模板，80 ℃5 s、37 ℃15 min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.5 real-time-PCR 引物序列 將逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 稀釋10 倍，取4 μL 為模板配制50 μL 反應(yīng)液。RGS 上游引物序列：5′-CAGAG GCCCAACAACACCTG-3′；下游引物序列：5′-TGTGGGTCTTCCCGCATTTT-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′；下 游 引 物 序 列：5′-ACACCAT GTATTCCGGGTCAAT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s、95 ℃退火5 s、60 ℃延伸31 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物分別為105、116 bp，得到Ct值后用2-△△Ct方法計(jì)算結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SSPS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞活力檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)中，用CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力，連續(xù)檢測(cè)4 d，可見(jiàn)肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH7 及正常肝細(xì)胞株THLE-2的細(xì)胞增殖呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)（圖1），表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可以進(jìn)行細(xì)胞水平mRNA 檢測(cè)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。

圖1 肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH7 及正常肝細(xì)胞株THLE-2 增殖曲線

2.2 HepG2、HuH7 及THLE-2 中RGS mRNA 的表達(dá) 3 種細(xì)胞抽提總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性見(jiàn)圖2。由圖2 可見(jiàn)，所抽提總RNA 28 s 條帶明亮，提示RNA 完整性好，未見(jiàn)降解，滿足下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及real-time PCR 的需要。real-time PCR結(jié)果顯示，設(shè)THLE-2 細(xì)胞RGS17 mRNA 表達(dá)水平為1，HepG2、HuH7 細(xì) 胞RGS17 mRNA 表 達(dá) 水 平 分 別 為3.20±0.92、11.60±2.53，提示肝癌細(xì)胞HepG2、HuH7 表達(dá)水平明顯高于正常肝細(xì)胞株THLE-2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 3 種細(xì)胞抽提RGS17總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 RGS17 mRNA 在3 種細(xì)胞株中的表達(dá)

2.3 裸鼠成瘤模型的建立 模型組裸鼠在注射HuH7 細(xì)胞后12 d，在裸鼠左側(cè)腹股溝處可見(jiàn)皮下瘤塊形成，待其繼續(xù)生長(zhǎng)14 d后，用游標(biāo)卡尺檢測(cè)腫瘤瘤塊大小，其體積如表1 所示。說(shuō)明在裸鼠皮下移植肝癌細(xì)胞成瘤造模成功。

2.4 裸鼠瘤塊組織及正常肝組織中RGS17 mRNA 的表達(dá) 用real-time PCR 方法檢測(cè)裸鼠瘤塊組織及肝組織中RGS17 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組有8 只裸鼠瘤塊組織中RGS17 mRNA 高表達(dá)，2 只裸鼠瘤塊組織中RGS17 mRNA 低表達(dá)，見(jiàn)圖4、5。

表1 模型組裸鼠瘤塊生長(zhǎng)情況（n=10）

圖4 裸鼠瘤塊組織和肝組織中RGS17 mRNA 的表達(dá)

圖5 瘤塊組織和肝組織RGS17 mRNA 表達(dá)散點(diǎn)圖

3 討 論

肝癌在所有癌癥中為高發(fā)腫瘤，在男性人群中排名第5 位，在女性人群中排名第7 位[3]。世界范圍內(nèi)每年約有60 萬(wàn)人死于肝癌，其在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較高[4]。因此，目前對(duì)于肝癌發(fā)病機(jī)制的研究以及據(jù)此制定相應(yīng)的預(yù)防、診斷和治療策略，成為世界范圍內(nèi)迫切需要研究的重要課題。

G 蛋白位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，是細(xì)胞膜表面受體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器的連接橋梁[5]，可調(diào)節(jié)下游效應(yīng)器如腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)通路的活性[6]。G 蛋白信號(hào)通路在正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)和再生中起重要作用[7]。在肝細(xì)胞癌患者和動(dòng)物模型中G 蛋白的表達(dá)和功能失常。有文獻(xiàn)報(bào)道，G 蛋白偶聯(lián)受體87（GPR87）可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[8]；GPR 5 在肝癌細(xì)胞表達(dá)異常，參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的表型和生存[9]。除上述G 蛋白、GPR 在肝癌的相關(guān)研究外，RGS 逐漸被納入人們的研究視線[10]。

RGS 調(diào)節(jié)G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率和持續(xù)時(shí)間、細(xì)胞內(nèi)RGS蛋白的分布和活性決定G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率以及不同G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的平衡調(diào)節(jié)[11]。已發(fā)表的關(guān)于RGS 的研究大多局限在神經(jīng)系統(tǒng)[12]，而在其他主要器官如肝臟的研究少見(jiàn)。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，RGS5 通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞從上皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)化來(lái)促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移[13]；RGS19 則可以抑制RAS 誘導(dǎo)的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[14]。

本研究以RGS17 為研究切入點(diǎn)，在體外細(xì)胞株和裸鼠動(dòng)物體內(nèi)2 個(gè)層面發(fā)現(xiàn)其在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示RGS17 可能參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，與其他RGS 參與腫瘤的報(bào)道互為印證，為肝癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路，為肝癌的預(yù)防和治療提供了新的分子靶點(diǎn)。但有關(guān)RGS17 促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制和調(diào)節(jié)功能尚需進(jìn)一步研究。

[1] Kawai Y，Arinze IJ.Glucocorticoid regulation of G-protein subunits in neonatal liver[J]. Mol Cell Endocrinol，1993，90（2）：203-209.

[2] McKillop IH，Wu Y，Cahill PA，et al. Altered expression of inhibitory guanine nucleotide regulatory proteins（Gi-proteins）in experimental hepatocellular carcinoma[J].J Cell Physiol，1998，175（3）：295-304.

[3] El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma：epidemiology and molecular carcinogenesis[J].Gastroenterology，2007，132（7）：2557-2576.

[4] Zhu LF，Hu Y，Yang CC，et al. Snail overexpression induces an epithelial to mesenchymal transition and cancer stem cell-like properties in SCC9 cells[J]. Lab Invest，2012，92（5）：744-752.

[5] Gurevich VV，Gurevich EV. Rich tapestry of G protein-coupled receptor signaling and regulatory mechanisms[J]. Mol Pharmacol，2008，74 （2）：312-316.

[6] Woehler A，Ponimaskin EG.G protein—mediated signaling：same receptor，multiple effectors[J].Curr Mol Pharmacol，2009，2（3）：237-248.

[7] Diehl AM，Yang SQ，Wolfgang D，et al.Differential expression of guanine nucleotide-binding proteins enhances cAMP synthesis in regenerating rat liver[J].J Clin Invest，1992，89（6）：1706-1712.

[8] Yan M，Li H，Zhu M，et al.G protein-coupled receptor 87（GPR87）promotes the growth and metastasis of CD133+cancer stem-like cells in hepatocellular carcinoma[J].PLoS One，2013，8（4）：e61056.

[9] Fukuma M，Tanese K，Effendi K，et al. Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 regulates epithelial cell phenotype and survival of hepatocellular carcinoma cells[J].Exp Cell Res，2013，319（3）：113-121.

[10] Olechnowicz SW，F(xiàn)edele AO，Peet DJ. Hypoxic induction of the regulator of G-protein signalling 4 gene is mediated by the hypoxiainducible factor pathway[J].PLoS One，2012，7（9）：e44564.

[11] Xie GX，Palmer PP.How regulators of G protein signaling achieve selective regulation[J].J Mol Biol，2007，366（2）：349-365.

[12] Burns ME，Wensel TG. From molecules to behavior：new clues for RGS function in the striatum[J].Neuron，2003，38（6）：853-856.

[13] Hu M，Chen X，Zhang J，et al. Over-expression of regulator of G protein signaling 5 promotes tumor metastasis by inducing epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells[J].J Surg Oncol，2013，108（3）：192-196.

[14] Wang Y，Tong Y，Tso PH，et al. Regulator of G protein signaling 19 suppresses Ras-induced neoplastic transformation and tumorigenesis[J].Cancer Lett，2013，339（1）：33-41.