楊玎玲，杭華，黃敏，許飛躍，付傳香，江波

1(安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖，241003)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(EC4.2.2.18，Inulin fructotransferase，IFTase)可催化水解菊糖轉(zhuǎn)化為雙果糖酐III，(DFA III)。DFA III具有清涼的甜味，甜度為蔗糖的52%，其熱值(0.263 kcal/g)為蔗糖的1/15，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型天然功能性甜味劑，具有增進(jìn)骨骼生長、改善便泌、利于排尿、促進(jìn)礦物元素和黃酮類物質(zhì)的吸收、預(yù)防結(jié)腸癌及抑制蛀牙等生理功能，因而在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景［1］。DFA III主要采用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。Uchiyama首次從產(chǎn)脲節(jié)桿菌中發(fā)現(xiàn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶IFTase(inulin fructotransferase，EC 4.2.2.18);迄今為止，已發(fā)現(xiàn)10余種微生物可以產(chǎn)生此酶，有節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)、黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、賴氏菌屬(Leifsonia sp.)等［2］。日本甜菜制糖株式會社采用Arthrobacter sp.H65-7發(fā)酵產(chǎn)生IFTase，已工業(yè)化生產(chǎn)DFA III。本研究采用金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens SK 8.001)產(chǎn)IFTase酶［3］，進(jìn)行固定化的研究。目前，采用海藻酸鈉進(jìn)行的研究有固定化 β-葡萄糖苷酶［4-5］、β-葡萄糖醛酸苷酶［6］等。本研究采用明膠-海藻酸鈉進(jìn)行菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的固定化研究，探究了固定化的最佳工藝條件、固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)、操作穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens SK 8.001);海藻酸鈉、明膠、無水 CaCl2、NaNO3、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、FeSO4·7H2O(分析純)，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;菊糖，上海譜振生物科技有限公司;雙果糖酐III，日本大阪光純化學(xué)工業(yè)公司。

恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;紫外可見分光光度計、冷凍離心機(jī)、電子天平，上海精密儀器有限公司;pH計，上海三本環(huán)?？萍加邢薰?高效液相色譜，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的制備

將金黃節(jié)桿菌接入200 mL培養(yǎng)基(25 g/L菊糖、3 g/L NaNO3、1 g/L 酵母膏、0.1 g/L MgSO4、0.4 g/L KH2PO4、0.01 g/L FeSO4·7H2O)中，培養(yǎng) 24 h(30 ℃，200 r/min);將培養(yǎng)液離心(8 000 r/min，20 min，4℃)，去除菌體，上清液即為粗酶液。上清液超濾除去小分子雜質(zhì)，濃縮液即為粗酶，0～4℃保藏。

1.2.2 酶的固定化

將海藻酸鈉和明膠分別在60℃預(yù)先保溫溶解，5 mL IFTase酶液(酶活約為300 U/mL)與10 mL海藻酸鈉溶液充分混合攪拌，再加入5 mL明膠溶液，混合乳化30～40 min。用注射器混合液滴入CaCl2液中，形成均一光滑的顆粒，0～4℃靜置硬化一定時間。將獲得顆粒用生理鹽水和去離子水洗滌，抽濾干燥即得固定化酶，保存于0～4℃下待用。

1.2.3 酶固定化的條件處理

探究對酶固定化效果影響較大的4個因素，即海藻酸鈉濃度、明膠濃度、CaCl2濃度、硬化時間等。采用4因素的組合進(jìn)行包埋法固定化酶實(shí)驗(yàn)，將其與游離酶混勻靜置30～40 min，用注射器吸取混合液逐滴滴入在20 g/L的CaCl2溶液中，室溫條件下靜置固定2 h，抽濾干燥，討論固定化酶的最適條件及其酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.4 酶活力測定方法［7］

菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酶活測定方法［6］。

反應(yīng)體系(1 mL):0.5 mL 10%的菊糖溶液，0.45 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.5)，0.05 mL酶液;充分混合后，60℃ 反應(yīng)10 min，100℃ 5 min滅酶活，10 000 r/min 10 min，取上清液檢測。

HPLC檢測條件:糖柱(Waters Sugur-PakTM1，6.5 mm×300 mm);流動相，超純水;示差折光檢測器(Shodex RI101);柱溫，80℃;流速，0.4 mL/min;進(jìn)樣量，10 μL。

酶活力單位定義:在上述檢測條件下，每分鐘生成1 μmol DFAIII所需要的酶量定義為1個酶活單位(即1U)。

酶活回收率:固定化酶活力與游離酶總活力的百分比。

1.2.5 酶蛋白質(zhì)包埋率的測定［8］

分別檢測包埋固定化中加入的游離酶總活性與固定化后上清液的酶活，計算酶蛋白包埋率:

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

本研究中，實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)均為3次，計算平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)值以平均值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)值的誤差以誤差棒表示。采用Origin 7.5軟件(美國OriginLab中國分公司，中國廣州)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊糖水解產(chǎn)物-DFA III

依據(jù)1.2.4的方法，IFTase催化水解菊糖，主要產(chǎn)物為DFA III以及少量的低聚果糖，見圖1。圖1(A)為菊糖液相圖，本研究采用菊糖為進(jìn)口品，純度高于90%且其聚合度較高;菊糖多為混合品，然而其HPLC(糖柱)圖為單峰圖。由圖1(B)可以看出，未反應(yīng)菊糖出峰時間為6.394 min，低聚果糖(蔗果四糖、蔗果三糖、蔗果二塘)分別對應(yīng)出峰時間為7.197 min、7.643 min及8.372 min，DFA III出峰時間為9.748 min。菊糖轉(zhuǎn)化率(生成DFA III)能達(dá)到80%。

圖1 菊糖及其水解產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.1 HPLC scheme of inulin and its hydrolysis products

2.2 固定化最適條件的優(yōu)化確定

2.1.1 明膠、海藻酸鈉濃度的確定

采用不同濃度的海藻酸鈉溶液和明膠溶液組合，按照1.2.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測并計算酶蛋白的包埋率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。當(dāng)明膠濃度為20 g/L與海藻酸鈉濃度為20 g/L時，酶蛋白包埋率最高且達(dá)到96.4%，顆粒均勻且強(qiáng)度適中。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是包埋載體濃度偏低時凝膠顆粒結(jié)構(gòu)松散，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且機(jī)械強(qiáng)度較低，酶蛋白易流失;包埋載體濃度偏高時，溶液黏度過高且混勻不充分，造成酶蛋白包埋率偏低，不易操作，推壓注射器困難，固定化酶顆粒形狀不規(guī)則，影響固定化酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致催化效率偏低。

表1 明膠與海藻酸鈉濃度和酶蛋白包埋率的關(guān)系Table 1 Relationships of enzyme protein encapsulation rate and gelatin and sodium alginate concentrations

2.1.2 CaCl2濃度的確定

保持海藻酸鈉溶液與明膠溶液濃度分別為20 g/L，分別選取濃度為 1、20、30、40、50、60 g/L 的 CaCl2溶液進(jìn)行酶固定化處理，在0～4℃下固定2 h，抽濾干燥，測定固定化酶活回收率，結(jié)果如圖2所示。固定化酶活回收率隨著CaCl2濃度的增加而快速增加，當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到40 g/L時，固定化酶活回收率最高;當(dāng)CaCl2濃度超過40 g/L時，固定化酶活回收率呈下降趨勢。原因可能是CaCl2濃度偏低，凝膠交聯(lián)度不夠，酶易流失;CaCl2濃度過高，促使顆粒空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于緊密，影響酶的空間結(jié)構(gòu)，抑制酶與底物的結(jié)合以及產(chǎn)物的釋放。因此，確定CaCl2的最佳濃度為40 g/L。

圖2 CaCl2濃度與固定化酶活回收率的關(guān)系Fig.2 Relationships of CaCl2concentration and the recovery rate of immobilized enzyme

2.1.3 固定化酶量的確定

分別取簡易濃縮酶液(酶活約為300 U/mL)3、4、5、6 mL，均勻混合于明膠濃度2%與海藻酸鈉濃度2%的混合液，用注射器吸取混合液逐滴滴入40 g/L的CaCl2溶液，進(jìn)行固定化酶處理，在0～4℃下固定2 h，抽濾干燥，收集固定化酶顆粒，測定固定化酶活回收率，結(jié)果如圖3所示。固定化酶量為5 mL時測定的相對酶活最高，因此，選擇5 mL固定化酶量進(jìn)行后續(xù)的研究。

2.1.4 固定化時間的確定

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法獲得固定化酶顆粒后，將其置于0～4℃下靜置硬化不同時間，將所得固定化顆粒洗滌、干燥后測定酶活，并以最大酶活為100% 計算相對酶活，結(jié)果如圖4所示。固定化顆粒的相對酶活隨著硬化時間的增加而增加，固定化6 h相對酶活達(dá)到最大值;隨著固化時間增加，固定化顆粒的相對酶活下降。原因可能是固化時間短，Ca2+未能將固定化顆粒中的Na+完全置換出來，交聯(lián)度不夠，機(jī)械強(qiáng)度弱，導(dǎo)致酶蛋白流失;固化時間長，包埋酶越牢固，抑制酶與底物結(jié)合及產(chǎn)物釋放。

圖3 固定化酶量與固定化酶活的關(guān)系Fig.3 Relationships of immobilized enzyme activities and protein weights of immobilized enzyme

圖4 固化時間與相對酶活的關(guān)系Fig.4 Relationships of relative enzyme activities and the fixed times

2.2 正交試驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，A因素依據(jù)表1設(shè)定，主要考察指標(biāo)為相對酶活，結(jié)果如表2所示。

表2 固定化條件的正交實(shí)驗(yàn)Table 2 The orthogonal experiment of immobilized conditions

影響酶活的因素依次為C＞B＞A＞D;相對酶活最高的組合為A2B2C3D1，根據(jù)2.1.4的結(jié)果，固定化時間5～7 h相對酶活變化不大，因此，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用A2B2C3D1。最佳固定化條件為:海藻酸鈉濃度為2%，明膠濃度為2%，CaCl2濃度為4%，包埋酶量為5 mL，固定化時間為5 h。

2.3 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 固定化酶的最適溫度

在上述最適固定化酶操作條件下，海藻酸鈉溶液與明膠溶液的濃度均為20 g/L、CaCl2濃度為40 g/L、靜置硬化6 h，取適量游離酶和固定化酶，分別在40～80℃下反應(yīng)，測定并計算固定化酶和游離酶的相對酶活，結(jié)果如圖5所示。游離酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，而固定化酶的最適反應(yīng)溫度為65～70℃，固定化酶的耐熱性高于游離酶，這也體現(xiàn)了固定化酶的優(yōu)勢所在，更適合工業(yè)化應(yīng)用。

圖5 溫度對游離酶和固定化酶相對酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on the relative enzyme activities of free enzyme and immobilized enzyme

2.3.2 固定化酶的最適pH值

取適量的游離酶和固定化酶，分別在pH 4.0～8.0的范圍內(nèi)，進(jìn)行酶促反應(yīng)，分別測定游離酶與固定化酶的相對酶活，結(jié)果如圖6所示。游離酶的最適pH值為5.5，而固定化酶的最適pH值為5.5～6.0，固定化酶的曲線較游離酶曲線平緩，固定化酶具有較好的耐堿性，因而其比游離酶具有較好的適應(yīng)性。

2.3.3 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性比較

采用上述的最佳反應(yīng)條件，取適量的游離酶和固定化酶，在20～80℃，每增加10℃并處理2 h后測定其殘余酶活力，結(jié)果如圖7所示。與圖5隨溫度變化趨勢不同，原因是前者為隨著溫度逐漸升高，檢測溫度對酶催化反應(yīng)的酶活力影響，確定酶與固定化酶的最適反應(yīng)溫度及酶失活溫度;而后者是酶與固定化酶經(jīng)不同溫度處理后，檢測相對酶活力的變化，確定酶與固定化酶的穩(wěn)定性的差異。由圖7可知，在20～50℃熱處理2 h后，固定化酶活力與游離酶的酶活力都有所下降，但變化幅度不大，當(dāng)溫度高于65℃后，固定化酶的酶活損失較游離酶酶活損失較小，可見酶蛋白被固定化后耐熱性有所提高，分析可能是固定化后形成的凝膠結(jié)構(gòu)對酶起到保護(hù)作用。

圖6 pH值對游離酶和固定化酶相對活力的影響Fig.6 Effects of pH on the relative enzyme activities of free enzyme and immobilized enzyme

圖7 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性比較Fig.7 Comparisons of thermal stabilities of free enzyme and immobilized enzyme

2.3.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性

取適量的固定化酶，在相同反應(yīng)條件下連續(xù)進(jìn)行8批次操作，并測定其相對酶活，并以第1批次相對酶活為100%，計算其他批次操作的相對酶活，結(jié)果如圖8所示。連續(xù)操作8次后，殘余酶活仍在50%以上，說明固定化酶有較好的操作穩(wěn)定性。

2.3.5 固定化酶的貯藏穩(wěn)定性

在4℃冰箱中，游離酶貯藏60天后，其相對酶活幾乎為0。由圖9可知，固定化酶貯存60天后，固定化酶保存50%以上的相對酶活，說明固定化酶有較好的貯存穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

圖8 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.8 Operational stability of immobilized enzyme

圖9 固定化酶的貯藏穩(wěn)定性Fig.9 Storage stability of immobilized enzyme

以海藻酸鈉和明膠為載體，對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行固定化，研究得出制備固定化酶的最優(yōu)條件:20 g/L海藻酸鈉、20 g/L明膠、40 g/L CaCl2、固定化時間5 h，在該條件下具有較好的操作穩(wěn)定性，重復(fù)操作8次后相對酶活保留50%以上。與游離酶相比，固定化酶的最適反應(yīng)pH值增加了0.5，反應(yīng)溫度分別提高了5～10℃，具有良好的操作穩(wěn)定性。該方法成本較低，操作簡單，操作穩(wěn)定性好，適用性廣，具有良好的應(yīng)用前景。目前，固定化菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行初步研究，將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，還需進(jìn)一步進(jìn)行研究，如對固定化酶動力學(xué)研究及固定化酶反應(yīng)器的研究等。

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