王垣芳， 修金霞， 趙 峰， 李祖成， 鄭 珊

（1.濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.濱州醫(yī)學(xué)院 煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264003）

人體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多可導(dǎo)致組織細(xì)胞氧化損傷，誘發(fā)各種疾病、加速衰老[1]。來(lái)源于植物的黃酮類、苯酚類、多糖類等物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化活性。因此，近年來(lái)從植物中挖掘具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的天然抗氧化劑已成為研究的熱點(diǎn)之一。大量的研究表明，中草藥來(lái)源的黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性[2]，能有效地清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)與功能，在預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老方面具有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。

櫻桃（Cerasus pseudocerasus L.）為薔薇科李亞科的多年生木本植物，在我國(guó)分布極為廣泛，其葉、根、核及鮮果皆可入藥。櫻桃葉味辛苦、性溫、無(wú)毒，具有溫胃、健脾、止血、解毒等功效，還能降壓、治胃寒食積、腹瀉、吐血、瘡毒等病癥[5]。研究表明，櫻桃葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[6]，但對(duì)櫻桃葉黃酮的抗氧化活性研究國(guó)內(nèi)尚有限。作者采用堿提酸沉法從櫻桃葉中提取總黃酮，考察其對(duì)羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除作用，對(duì)H2O2誘發(fā)小鼠紅細(xì)胞氧化溶血及肝脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用，為櫻桃葉黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 器材

1.1 主要儀器設(shè)備

KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司制造；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司制造；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司制造；Waters 600E高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司制造；電子天平，Metter-Toledo儀器公司制造；RE-52-05型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠制造；DL-5000B型低速冷凍多管離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；層析柱，鹽城泓宇玻璃儀器廠制造。

1.2 材料與試劑

櫻桃葉，初秋采自煙臺(tái)市牟平區(qū)高陵鎮(zhèn)；硫代巴比妥酸TBA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；蘆丁對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；D101大孔吸附樹(shù)脂，上海開(kāi)平樹(shù)脂有限公司產(chǎn)品；體積分?jǐn)?shù)95%植物乙醇，以及石油醚、七水和硫酸亞鐵、抗壞血酸、三氯乙酸、鄰苯三酚、葡萄糖、鄰二氮菲、無(wú)水乙醇，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 櫻桃葉黃酮的提取

取干燥的櫻桃葉樣品適量，粉碎，60目過(guò)篩。準(zhǔn)確稱取櫻桃葉干粉約5 g，按料液比l g∶30 mL加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇150 mL，70℃回流浸提1.5 h后立即抽濾并收集濾液。將濾液轉(zhuǎn)至蒸發(fā)瓶中，減壓濃縮以除去提取溶劑。收集濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度。然后將提取液以4 000 r/min的速度離心l0 min，除去葉綠素和其他水不溶性雜質(zhì)，取上清液移至分液漏斗中，加入等體積的石油醚充分振蕩，靜置分層后分離收集下層液，即為樣品提取液，反復(fù)萃取直至上層液（石油醚）為無(wú)色，冷凍干燥，即得櫻桃葉粗黃酮干燥粉末。稱取櫻桃葉粗黃酮粉末0.1 g，用蒸餾水溶解，然后定容于100 mL的容量瓶中，得到1.0 mg/mL的櫻桃葉粗黃酮溶液。詳見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

2.2 櫻桃葉中黃酮含量測(cè)定

精密稱取蘆丁5 mg置于5 mL的量瓶中，配制成1 mg/mL的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色體系，以 510 nm 波長(zhǎng)比色法測(cè)定蘆丁系列濃度對(duì)照溶液的吸光度，以濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程

取1.0 mL櫻桃葉黃酮溶液，按上述方法顯色后，以試劑空白作為參比液測(cè)定吸光度，根據(jù)蘆丁直線回歸方程計(jì)算出溶液中黃酮的含量。詳見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。

2.3 櫻桃葉黃酮的純化及其溶液配制

選用D101大孔樹(shù)脂對(duì)櫻桃葉粗黃酮溶液進(jìn)行純化[9]。將上述1.0 mg/mL粗黃酮溶液pH值調(diào)為4.0，以每小時(shí)2倍體積的上樣流量進(jìn)行吸附，再用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、3倍柱體積進(jìn)行洗脫，洗脫流量為每小時(shí)2倍體積。收集洗脫液減壓濃縮至浸膏，經(jīng)真空干燥得到黃色粉末，加蒸餾水配制成1.0 mg/mL的櫻桃葉黃酮溶液，作為樣品儲(chǔ)備液，并配制1.0mg/mL維生素C溶液的樣品儲(chǔ)備液。

2.4 櫻桃葉黃酮對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用

取0.75 moL／L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中，加入 400 mmol／L 的 PBS（pH 7.4）緩沖液 2 mL 和蒸餾水1 mL，充分混勻后，加2.5 mmoL／L硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻，加 20 mmoL／L 的 H2O21 mL，置于37℃水浴1.5 h，在536 nm處測(cè)其吸光度，記作A1；用1 mL蒸餾水代替l mL H2O2，測(cè)得吸光度記作A2；用黃酮溶液1 mL代替1 mL蒸餾水，測(cè)得吸光度記作A3。按公式（2）計(jì)算OH·自由基清除率

2.5 櫻桃葉黃酮對(duì)超氧陰離子（O2-·）的清除作用

于各試管中分別加入 0.05 mol／L Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液4.6 mL，加入l.0 mL黃酮溶液，混勻，在25℃水浴10 min，取出后立即加入經(jīng)25℃溫浴的0.06 moL／L鄰苯三酚溶液0.3 mL，對(duì)照管加入10 mmol／L的HCl 0.3 mL。各管充分混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)3 min（加人鄰苯三酚時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)）后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%維生素C溶液0.1 mL終止反應(yīng)。10 min后，在420 nm處測(cè)定吸光度，記作A′1；對(duì)照管以1 mL蒸餾水代替待測(cè)樣品，記作 A′2。 按公式（3）計(jì)算 O2-·清除率

2.6 櫻桃葉黃酮對(duì)H2O2誘發(fā)小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制作用

將受試小鼠斷頭取血，用肝素抗凝，2 000 r／min離心10 min得紅細(xì)胞，用4倍量生理鹽水洗滌并離心3次，然后用生理鹽水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的紅細(xì)胞懸浮液備用。取紅細(xì)胞懸浮液1 mL，加入100 mmol／L H2O2（空白管不加 H2O2）及黃酮溶液1 mL，37℃溫浴1 h，加入4倍量生理鹽水稀釋，3 000 r／min離心6 min，取上清液于415 nm處測(cè)定吸光度，按公式（4）計(jì)算溶血抑制率

式（4）中：AC為加入樣品后的H2O2誘導(dǎo)管的吸光度；AK為H2O2誘導(dǎo)管的吸光度；AD為不加H2O2的正常管的吸光度。

2.7 櫻桃葉黃酮對(duì)小鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用

按文獻(xiàn)[10]方法，將受試小鼠頸椎脫臼后立即打開(kāi)腹腔，從門靜脈注入預(yù)冷的生理鹽水沖洗后取出肝臟，稱質(zhì)量，按1 g∶9 mL的質(zhì)量與體積比加人預(yù)冷的生理鹽水，制成10 g/dL的肝勻漿液備用。取肝勻漿液1 mL加入試管中，分別加入0.5 mL不同質(zhì)量濃度的櫻桃葉黃酮溶液，空白對(duì)照加入等體積生理鹽水，混勻后37℃溫浴1 h，加入體積分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸溶液1 mL，混勻后再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的硫代巴比妥酸溶液1.5 mL，沸水浴15 min后3 000 r/min離心10 min，取上清液于波長(zhǎng)532 nm處測(cè)定各管的吸光度A。按公式（5）計(jì)算抑制率

式（5）中： A′C為加入樣品管的吸光度； A′K為體積分?jǐn)?shù)60%乙醇管的吸光度；A′D為生理鹽水管的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 櫻桃葉粗黃酮的提取及其含量

按照實(shí)驗(yàn)方法2.1，從5 g櫻桃葉樣品中提取粗黃酮0.28 g，產(chǎn)率為5.6%。按照實(shí)驗(yàn)方法2.2對(duì)櫻桃葉粗黃酮純化干燥后，得到黃酮干燥粉末0.18 g。

3.2 櫻桃葉黃酮對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用

由圖1可知，櫻桃葉黃酮對(duì)·OH具有清除作用，且隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)·OH的消除作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)較明顯的質(zhì)量濃度依賴性。在黃酮終質(zhì)量濃度為 30 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到85.67%，其對(duì)·OH的清除能力優(yōu)于維生素C。

圖1 櫻桃葉黃酮對(duì)·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of cherry leaves flavonoids on free radicals·OH

3.3 櫻桃葉黃酮對(duì)超氧陰離子（O2-·）的清除作用

從圖2可知，不同質(zhì)量濃度的櫻桃葉黃酮對(duì)O2-·均具有清除作用，且隨質(zhì)量濃度增大，樣品吸光度下降，對(duì)O2-·的清除率呈上升趨勢(shì)，在終質(zhì)量濃度為30 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到72.45%，其對(duì)O2-·的清除能力稍弱于維生素C。

3.4 櫻桃葉黃酮對(duì)H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的抑制作用

小鼠紅細(xì)胞懸液加入H2O2后吸光度值增大，表明H2O2可以氧化紅細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。從圖3可以看出，隨著櫻桃葉黃酮質(zhì)量濃度的增加，樣品吸光度逐漸增加，對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血抑制率逐漸增加，當(dāng)終質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，其溶血抑制率為79.82%，其對(duì)H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血的抑制率優(yōu)于維生素C。

圖2 櫻桃葉黃酮對(duì)O2-·的清除作用Fig.2 Scavenging effect of cherry leaves flavonoids on free radicals O2-·

圖3 櫻桃葉黃酮對(duì)H2O2誘發(fā)小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響Fig.3 Inhibition of cherry leaves flavonoids on hydrogen peroxide-induced erythrocyte hemolysis

3.5 櫻桃葉黃酮對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的影響

由圖4可以看出，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增加，樣品吸光度逐漸增加，對(duì)肝脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率相應(yīng)增高，當(dāng)終質(zhì)量濃度為30 μg/mL時(shí)，抑制率可達(dá)75.54%，其對(duì)肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制與維生素C接近。

圖4 櫻桃葉黃酮對(duì)肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用Fig.4 Inhibition of cherry leaves flavonoids on lipid peroxidation of hepatic homogenate

4 討論

·OH和O2-·等活性氧自由基可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一系列的損害，如損傷蛋白質(zhì)的巰基和氨基，使蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)，導(dǎo)致酶的活性喪失；損傷DNA，導(dǎo)致細(xì)胞突變；破壞多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能改變等。大量的研究表明，炎癥、衰老、腫瘤等多種疾病的起因和發(fā)展都與自由基損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)[11-12]。因此，近年來(lái)尋找安全有效的天然抗氧化劑一直倍受醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，櫻桃葉黃酮能有效地清除·OH和O2-·，其活性呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性，當(dāng)櫻桃葉總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，對(duì)·OH及對(duì)O2-·的清除率分別達(dá)到 85.67%和 72.45%，并且對(duì)·OH的清除能力優(yōu)于維生素C，而對(duì)O2-·的清除能力稍弱于維生素C；櫻桃葉黃酮對(duì)H2O2誘發(fā)小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率強(qiáng)于維生素C，當(dāng)終質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，其抑制率為79.82%；櫻桃葉黃酮對(duì)肝脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的抑制作用與維生素接近，當(dāng)終質(zhì)量濃度達(dá)到30μg/mL時(shí)，其抑制率為75.54%。

5 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，櫻桃葉黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，有可能具備防治自由基相關(guān)性疾病的天然抗氧化藥物、保健品或食品抗氧化劑的開(kāi)發(fā)潛力。

[1]Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J].Int J Biochem Cell Biol，2007，39（1）：44-84.

[2]Soobrattee M A，Neergheen V S，Luximon-Ramma A，et al．Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents：mechanism and actions[J]．Mutat Res，2005，579（1-2）：200-213.

[3]田永利，許志宇，葛林，等.總黃酮類化合物含量測(cè)定方法和藥理作用研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥，2010，8（15）：2094-2096.TIAN Yongli，XU Zhiyu，GE Lin，et al.Advances in methods of measuring and pharmacological effects of total flavonoids[J].Hebei Medical Journal，2010，8（15）：2094-2096.（in Chinese）

[4]程秋月，郭菁，張成義.黃酮類化合物藥理作用的研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，12（2）：180-183.CHENG Qiuyue，GUO Jing，ZHANG Chengyi.On the pharmacologic effect of flavanoids[J].Journal of Beihua University：Natural Science，2011，12（2）：180-183.（in Chinese）

[5]張杰，付佳，焦淑清.超臨界CO2萃取櫻桃葉中總黃酮的研究[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2009，32（2）：10-11.ZHANG Jie，F(xiàn)U Jia，JIAO Shuqing.Extraction of flavonoids from cherry leaves with supercritical CO2[J].Heilongjiang Medicine And Pharmacy，2009，32（2）：10-11.（in Chinese）

[6]李晨，姜子濤，李榮.櫻桃葉黃酮的微波提取及抗氧化性質(zhì)的研究[J].中國(guó)食品添加劑，2012（4）：103-108.LI Chen，JANG Zitao，LI Rong.Study on microwaveassisted extraction of flavones from prunus pseudocerasus leaves and its antioxidant activities[J].China Food Additives，2012（4）：103-108.（in Chinese）

[7]潘進(jìn)權(quán)，張世英，何敏婷，等.竹葉總黃酮提取工藝及抗氧化特性的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12（3）：39-44.PAN Jinquan，ZHANG Shiying，HE Minting，et al.Extracting process and antioxidation charater of flavonids from bamboo leaves[J].Jounal of Chinese Institute of Food Science and Technology，2012，12（3）：39-44.（in Chinese）

[8]林冠宇，姚楠，何蓉蓉，等.淡竹葉總黃酮對(duì)拘束負(fù)荷所致小鼠肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（7）：177-179.LIN Guanyu，YAO Nan，HE Rongrong，et al.Protective effects of Herbal lophatheri flavonoids on restraint Stress-Induced liver damage in mice[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2010，16（7）：177-179.（in Chinese）

[9]廖春燕，楊欣綠.D101型大孔樹(shù)脂純化雞骨草總黃酮的工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（2）：38-40.LIAO Chunyan，YANG Xinlv.Optimization of purification technology of total flavonoid from Abrus cantoniensis by D101 macroporous resin[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2013，19（2）：38-40.（in Chinese）

[10]黃一泓，劉雅莉，武文斌，等.藏紅花花瓣體外抗氧化活性部位的篩選與研究 [J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25：1489-1493，1567.HUANG Yihong，LIU Yali，WU Wenbin，et al.Bioaetivity-Guided fractionation of petals of Crocus sativus and their antioxidant activity investigation[J].Nat Prod Res Dev，2013，25：1489-1493，1567.（in Chinese）

[11]Dalle-Donne I，Giustarini D，Colombo R，et a1.Protein carbonylation in human diseases[J].Trends Mol Med，2003，9（4）：169-176.

[12]Dizdaroglu M，Jaruga P，Birinciodu M，et al.Free medical-induced damage to DNA：Mechanisms and measurement[J].Free Radic Biol Med，2002，32（11）：1102-1115.