王 靜， 耿 燕， 孫 青， 陸震鳴， 許正宏， 史勁松

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

肝纖維化是指許多慢性肝臟疾病發(fā)病過程中由各種致病因子所致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）過度沉淀的病理過程[1]，進一步發(fā)展為肝硬化、肝衰竭，往往需要肝移植來根治。但由于器官來源嚴(yán)重短缺，許多病人在等待器官過程中死亡，這已成為我國一個重要的公共衛(wèi)生問題[2]。

目前的研究認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）是正常及纖維化肝臟中ECM的主要合成細(xì)胞，HSCs增殖與凋亡的失衡是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)[3]。研究表明，多種細(xì)胞因子參與肝纖維化的發(fā)生，血小板衍生生長因子（PDGF）是強大的促HSC增殖因子，PDGF以自分泌、旁分泌的方式參與HSCs活化，且有很強的促纖維生成作用，可以顯著促進I型膠原合成[4]。

樟芝（Antrodia cinnamomea）[5]是一種僅分布在我國臺灣地區(qū)的珍稀擔(dān)子菌。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，樟芝子實體及菌絲體中含有眾多生理活性物質(zhì)，如三萜類化合物、多糖、SOD、腺苷、小分子蛋白質(zhì)及固醇類物質(zhì)等[5]?，F(xiàn)代藥理研究已證實，樟芝子實體及其發(fā)酵產(chǎn)物在保肝[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]方面具有獨特的功效。樟芝深層液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物已被證實對CCl4誘發(fā)的肝損傷及肝纖維化節(jié)結(jié)和二甲基亞硝胺（DMN）造成的肝纖維化都有明顯的阻礙作用[6，9]，但是其活性組分及作用機制研究還未見報道。

筆者前期從樟芝菌粉中分離得到Fr.2組分，具有較強的抗肝纖維化活性，但其作用機制還需進一步研究。水飛薊賓（Silybin）是從水飛薊種子的種皮中提取所得的一種黃酮化合物，具有抗肝纖維化活性[10]。因此，本實驗中以Fr.2為研究對象，以Silybin為陽性對照物，通過構(gòu)建PDGF-BB活化的CFSC-8B細(xì)胞模型，檢測Fr.2對PDGF-BB刺激的CFSC-8B細(xì)胞增殖及遷移效果，探討其抗肝纖維化的作用機制，旨在為深入研究樟芝防治肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 器材

1.1.1 材料與試劑 樟芝菌粉購自金穎生物科技股份有限公司，樟芝菌粉采用甲醇浸提，正己烷-水以體積比1∶1萃取，將正己烷萃取物通過硅膠柱色譜進行層析，獲得組分Fraction2（Fr.2），用于開展抗肝纖維化研究；RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS），購自美國Gibco公司；胰酶-EDTA消化液，青霉素，鏈霉素，購自碧云天公司；Silybin及MTT，購自美國Sigma公司；WST-1細(xì)胞增殖試劑盒，TRIZOL，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master，細(xì)胞裂解液，購自美國Roche公司；MAPK信號通路抗體，購自Cell Signaling Technology公司；其余試劑為分析純，購自國藥集團化學(xué)有限公司。

1.1.2 實驗細(xì)胞 大鼠肝星狀細(xì)胞株 CFSC-8B，購自中南大學(xué)湘雅中心實驗室細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI-1640培養(yǎng)基，內(nèi)含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS、青霉素和鏈霉素，在37℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯集至80%時進行傳代接種，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.1.3 儀器 EL204電子天平，博特勒托利多公司制造；MULTISKAN ASCENT酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司制造；CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司制造；倒置顯微鏡，Nikon公司制造；PCR擴增儀，Bio-Rad公司制造。

1.2 方法

1.2.1 體外PDGF-BB誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增殖模型的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期的CFSC-8B細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，24 h后用含有體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24 h，加入不同質(zhì)量濃度的 PDGF-BB （0、5、10、20 ng/mL），每組設(shè) 6個復(fù)孔，分別作用 24、36、48、72 h后，每孔加入10 μL WST-1，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1 h后，用酶標(biāo)儀檢測450 nm的OD值，參考波長為690 nm。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 將CFSC-8B細(xì)胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24 h后，加入Fr.2組分，使每孔終質(zhì)量濃度分別為3、6、12、25、50、100 μg/mL，每組設(shè) 6 個復(fù)孔，分別作用24、36、48、72 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min使紫色結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上測570 nm處OD值[11]。通過公式（2）及Graphpad軟件計算細(xì)胞存活率及IC50值。

1.2.3 細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移 調(diào)整對數(shù)期CFSC-8B細(xì)胞懸液濃度至3×105個/mL，以每孔1 mL細(xì)胞懸液接種到6孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至90%～100%融合度時，以體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS饑餓細(xì)胞24 h。用200 μL槍頭垂直插入孔中劃痕。PBS洗滌細(xì)胞，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS培養(yǎng)基配制的不同質(zhì)量濃度的 Fr.2 溶液及 Silybin（25 μmol/L）。每隔一定時間對細(xì)胞取樣拍照，使用Image J軟件計算劃痕面積，以劃痕面積的變化值定義細(xì)胞遷移率。

1.2.4 細(xì)胞小室遷移實驗檢測細(xì)胞遷移 Transwell小室濾膜為8 μm孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜（Millipore公司），調(diào)整對數(shù)生長期懸液濃度至2×105個/mL，加入 100 μL 于上室，將 Transwell小室放入預(yù)先加入500 μL含有體積分?jǐn)?shù)10%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基的24孔板中。加入不同質(zhì)量濃度的Fr.2及Silybin（25 μmol/L）后繼續(xù)在培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng) 24 h。取出濾膜，用棉簽擦去上室濾膜內(nèi)表面殘存細(xì)胞，對遷移至濾膜外表面的細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色，用體積分?jǐn)?shù)33%醋酸脫色抽提10 min，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液在酶標(biāo)儀上于570 nm處測定OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測相關(guān)基因表達情況 采用TRIZOL法，按試劑盒說明書提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green進行熒光定量PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法對α-SMA、Collagen I （Col 1）、Collagen Ⅲ （Col 3）和Fibronectin（Fn）基因的表達水平進行相對定量，計算各相關(guān)基因的表達倍數(shù)[12]，相關(guān)基因引物序列采用文獻[13-14]所述。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡（Western Blotting） 用4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的總蛋白質(zhì)抽提試劑，于冰上裂解30 min，超聲處理30 s以降解DNA。裂解產(chǎn)物在4℃下12 000 g離心10 min后得到細(xì)胞蛋白質(zhì)上清液，采用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后在冰浴條件下將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上，分別孵育一抗和二抗。ECL試劑盒（Thermo Scientific）顯色，利用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 根據(jù)One-Way ANOVA統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，極顯著水平為與對照組比較##P＜0.01，與PDGFBB誘導(dǎo)組比較**P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外PDGF-BB誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增殖模型的建立

由表1可知，5～20 ng/mL范圍的PDGF-BB可誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞增殖，與對照組相比，差異極顯著（**P＜0.01），呈現(xiàn)劑量及時間依賴性。PDGF-BB 20 ng/mL和10 ng/mL促增殖作用相比差異不顯著，所以選擇10 ng/mL PDGF-BB作用CFSC-8B細(xì)胞48 h為最佳細(xì)胞增殖模型。

表1 PDGF-BB質(zhì)量濃度和孵育時間對CFSC-8B細(xì)胞增殖率的影響Table 1 Proliferation effect of PDGF-BB on CFSC-8B cells，Proliferation %

2.2 Fr.2對CFSC-8B細(xì)胞生長的影響

如圖1所示，不同質(zhì)量濃度的Fr.2作用CFSC-8B細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞存活率受到不同程度的抑制。細(xì)胞存活率隨著作用時間及Fr.2質(zhì)量濃度增加而呈逐漸下降趨勢，F(xiàn)r.2在0～12 μg/mL范圍內(nèi)對CFSC-8B細(xì)胞存活率無明顯抑制，其細(xì)胞存活率均在90%以上；但在高質(zhì)量濃度的Fr.2作用下，CFSC-8B細(xì)胞出現(xiàn)了較多的死亡，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞生長抑制效應(yīng)，本實驗中選定Fr.2 0～25 μg/mL的范圍與CFSC-8B細(xì)胞孵育48 h進行后續(xù)研究。通過Graphpad分析得出Fr.2與CFSC-8B細(xì)胞共孵育 48 h的 IC50值為 56.46 μg/mL。

2.3 Fr.2對PDGF-BB誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞增殖的影響

采用體外PDGF-BB誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞增殖模型，檢測了Fr.2對PDGF-BB刺激的CFSC-8B細(xì)胞增殖的影響（圖2），10 ng/mL PDGF-BB可極顯著誘導(dǎo) CFSC-8B 細(xì)胞增殖（##P＜0.01），而 6、12、25 μg/mL Fr.2可極顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增殖（**P＜0.01），且具有劑量依賴性，其中 25 μg/mL Fr.2的抑制率為71.8%，這與陽性對照Silybin（25 μmol/L）的抑制率（70.8%）相當(dāng)。

圖1 Fr.2對CFSC-8B細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of Fr.2 on the cell proliferation in CFSC-8B cells

圖2 不同質(zhì)量濃度Fr.2對于PDGF-BB誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Fr.2 on the cell proliferation induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

2.4 Fr.2對PDGF-BB誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞遷移的影響

HSCs向肝內(nèi)炎癥區(qū)域遷移，可導(dǎo)致炎癥區(qū)域活化的HSCs數(shù)目增多，加重病灶局部的纖維化程度。所以，如能抑制HSCs在肝損傷時向炎癥區(qū)域遷移，就可能干擾或減輕纖維化進程。

細(xì)胞劃痕實驗顯示，各實驗組中CFSC-8B細(xì)胞從劃痕邊緣向劃痕內(nèi)遷移，24 h后遷移的細(xì)胞呈單層鋪路卵石樣排列（圖3（a））；與對照組比較，計算各區(qū)域細(xì)胞遷移率（圖3（b））。結(jié)果表明，PDGF-BB刺激24 h后，細(xì)胞遷移的距離明顯高于對照組（##P＜0.01），F(xiàn)r.2（6、12、25 μg/mL）與 PDGF-BB 細(xì)胞共孵育組細(xì)胞遷移率顯著低于PDGF-BB組（**P＜0.01），說明一定劑量的Fr.2可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。

圖3 不同質(zhì)量濃度Fr.2對于PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞劃痕損傷的作用Fig.3 Effect of Fr.2 on the cell scratch wound induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

細(xì)胞小室遷移實驗進一步驗證了Fr.2對PDGF-BB誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞遷移有抑制作用，結(jié)果如圖4所示。

PDGF-BB可顯著誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞遷移，與對照組相比差異極顯著（##P＜0.01）。Fr.2可顯著抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的 CFSC-8B 細(xì)胞遷移（**P＜0.01），呈現(xiàn)劑量依賴性。25 μg/mL Fr.2細(xì)胞遷移抑制率為65.0%，而25 μmol/L Silybin的抑制率為 69.1%，結(jié)果表明25 μg/mL Fr.2抑制細(xì)胞遷移的效果優(yōu)于Silybin。

圖4 不同質(zhì)量濃度Fr.2對于PDGF-BB誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞遷移的作用Fig.4 Effect of different concentrations of Fr.2 on the cell migration induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

2.5 Fr.2對CFSC-8B細(xì)胞肝纖維化相關(guān)基因表達情況的影響

在分子水平上進一步檢測Fr.2對于PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC活化及細(xì)胞外基質(zhì)表達的影響。圖5 qRT-PCR結(jié)果顯示，10 ng/mL PDGF-BB可顯著誘導(dǎo)HSCs活化標(biāo)記α-SMA基因表達，并顯著上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì) Col1、Col3 及 Fn 基因表達（##P＜0.01）。 而Fr.2 （6、12、25 μg/mL） 顯著抑制 PDGF-BB 誘導(dǎo)的α-SMA、Col1、Col3 及 Fn 基因表達（**P＜0.01），且具有劑量相關(guān)性（圖 5）。

2.6 Fr.2對MAPK信號通路的影響

在明確了Fr.2組分對CFSC-8B細(xì)胞增殖、遷移及肝纖維化相關(guān)基因表達的抑制作用后，進一步研究了其對PDGF介導(dǎo)的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。

如圖6所示，對照組的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑處于低水平狀態(tài)，PDGF-BB誘導(dǎo)的CFSC-8B細(xì)胞MAPK途徑下游信號分子，如磷酸化Extracellular signalregulated kinase （p-ERK）、 磷酸化 c-Jun NH2-terminal kinase（p-JNK），及磷酸化P38 mitogenactivated protein kinases（p-P38），它們的表達較正常對照組明顯增強（##P＜0.01）。用Fr.2處理細(xì)胞后，PDGF-BB誘導(dǎo)的 CFSC-8B細(xì)胞 p-ERK、p-JNK、p-P38 的表達受到抑制（**P＜0.01）。

圖 5 不同質(zhì) 量 濃 度 Fr.2對 α-SMA、Col1、Col3及 Fn mRNA相對表達量的影響Fig.5 Effect of Fr.2 on the relative expression of α-SMA、Col1、Col3 and Fn mRNA

3 結(jié)語

圖6 Fr.2對 CFSC-8B細(xì)胞 p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白質(zhì)表達的影響Fig.6 Effect of Fr.2 on expression of p-ERK、p-JNK、p-P38 in CFSC-8B cells

過去認(rèn)為肝纖維化是持續(xù)的不可逆的過程，但目前有病例稱重度肝纖維化仍可逆轉(zhuǎn)，這極大激發(fā)了研究人員從事開發(fā)抗肝纖維化藥物[15]。通過抑制HSCs活化來控制肝纖維化，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。

HSCs是位于Disse間隙的一種間質(zhì)細(xì)胞，正常情況下處于靜息狀態(tài)，經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激活化后HSCs大量增殖，合成包括膠原在內(nèi)的各種細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致肝臟內(nèi)膠原的異常沉積而發(fā)展成為纖維化[3]。其中PDGF是重要的促有絲分裂因子，可通過激活MAPK信號通路，促進HSCs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)如膠原表達增加[16]。

作者構(gòu)建了體外PDGF-BB活化的CFSC-8B細(xì)胞模型，進一步利用此模型檢測Fr.2對CFSC-8B細(xì)胞的作用。 結(jié)果表明：Fr.2（6～25 μg/mL）能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)CFSC-8B細(xì)胞的增殖及遷移，且呈劑量依賴性。并顯著降低PDGF-BB誘導(dǎo)的α-SMA、Col1、Col3及Fn基因表達水平。

MAPK通路有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞間功能同步化等重要功能，MAPK蛋白質(zhì)家族包括ERK、JNK和P38[17]。MAPK途徑也是HSCs中重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究顯示，F(xiàn)r.2可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中p-ERK、p-JNK及p-P38表達。由此推測Fr.2可能通過阻止CFSC-8B細(xì)胞增殖及向損傷部位遷移，下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的表達，從而阻止肝纖維化的發(fā)生，其機制可能與抑制胞內(nèi)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

對樟芝提取物的Fr.2組分進一步分離，并鑒定其活性化合物的結(jié)構(gòu)，進而研究其抗肝纖維化的機制，將有助于抗肝纖維化藥物的研制。

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