余 濤， 胡 蝶， 鄔敏辰， 汪俊卿， 馮 峰， 顧 穎

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122）

葡 萄 糖 脫 氫 酶 （EC 1.1.1.47，glucose 1-dehydrogenase，GDH）能夠特異性地催化D-葡萄糖生成葡萄糖酸，并伴隨 NAD（P）+向輔酶 NAD（P）H的轉(zhuǎn)化。與輔酶循環(huán)系統(tǒng)中甲酸脫氫酶和乳酸脫氫酶相比，葡萄糖脫氫酶利用廉價的葡萄糖，并可適用于NADH和NADPH的再生，因此在輔酶循環(huán)系統(tǒng)中，葡萄糖脫氫酶常為生物催化氧化還原反應提供還原力氫[1-3]。在生物催化氧化還原反應中，底物大都不溶于水，為提高底物的溶解度，常需使用有機溶劑作為助溶劑，但有機溶劑能破壞蛋白質(zhì)表面的水化層使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導致酶蛋白質(zhì)失活[4]，這種催化體系的限制使得耐有機溶劑的生物酶的市場需求更加迫切。目前，雖已有關(guān)耐有機溶劑葡萄糖脫氫酶的報道，但數(shù)量較少，如來源于芽胞桿菌 （Bacillus sp）[5]、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）[6]、 嗜 酸 熱 源 體（Thermoplasma acidophilum）[7]的葡萄糖脫氫酶等。耐有機溶劑的葡萄糖脫氫酶也越來越受到廣大生物催化研究者的青睞[8-11]。

1989年，Smith[7]等從嗜酸熱源體（T.acidophilum）中獲得的野生型葡萄糖脫氫酶 （GDH）既能耐受有機溶劑，還具有耐高溫的特點，在75℃時的半衰期為3 h。2000年，隨著嗜酸熱源體基因組的破解，該葡萄糖脫氫酶 （GDH）的基因可較容易地從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得[12]?；谑人釤嵩大w葡萄糖脫氫酶優(yōu)良的酶學性質(zhì)，作者將其基因gdh（GenBank登錄號：CAC12026.1）進行了密碼子優(yōu)化后人工合成基因，命名為Sygdh，并將該基因在大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）中高效表達。同時，作者還研究了重組葡萄糖脫氫酶 （SyGDH）溫度、pH、輔酶依賴性及有機溶劑耐受性等酶學性質(zhì)，并利用葡萄糖脫氫酶重組菌和作者所在研究室構(gòu)建的NADPH依賴型羰基還原酶重組菌E.coli BL21/pET28a-S1構(gòu)建偶聯(lián)輔酶再生體系，研究其偶聯(lián)輔酶再生性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌 E.coli JM109 和 E.coli BL21（DE3），購自Invitrogen公司；大腸桿菌E.coli BL21/pET28a-S1，由作者所在實驗室保藏；克隆質(zhì)粒pUCm-T，購自上海Sangon公司；表達質(zhì)粒pET28a，購自Invitrogen公司。

LB 培養(yǎng)基 （質(zhì)量分數(shù)）：1%Tryptone，0.5%Yeast Extract，1%NaCl（固體培養(yǎng)基添加質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂）。

1.2 主要試劑和儀器

rTaq酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶Nco I、Hind III、 250 bp DNA Ladder Marker、 λ-Hind Ⅲdigest DNA Ladder Marker和低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker，購于大連TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 （IPTG）和EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒，購自上海 Sangon公司；NAD+、NADPH、NADP+，購于上海源葉生物科技有限公司；4-氯乙酰乙酸乙酯、（R）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯、（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯，購于北京百靈威科技有限公司；一站式His標記蛋白質(zhì)微量純化套裝，購于北京天恩澤有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

Thermo MK3型酶標儀，購于美國Thermo公司；GC-20104 AFSC，購自SHIMADZU公司；手性氣相色譜柱 Chirasil-Dex-CB（CP7502，25 m×0.25 nm×0.25 μm），購自美國 Agilent科技公司。

1.3 Sygdh基因的密碼子優(yōu)化及合成

由于宿主細胞的不同，其對編碼氨基酸的密碼子也存有不同的偏愛性[13]。通過對來源于嗜酸熱源體的GDH成熟肽基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其密碼子偏愛性與大腸桿菌的密碼子偏愛性有一定差異。為實現(xiàn)該GDH基因gdh在大腸桿菌中的高效表達，參照大腸桿菌偏愛性密碼子表對gdh中的稀有密碼子進行優(yōu)化，并在該基因N端引入6個編碼組氨酸的標簽序列，在兩端分別添加Nco I和Hind III限制性酶切位點。優(yōu)化后基因命名為Sygdh，由上海Sangon公司合成并與pUCm-T連接，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-Sygdh。

1.4 重組表達質(zhì)粒pET28a-Sygdh的構(gòu)建

將pUCm-T-Sygdh進行Nco I和Hind III雙酶切，膠回收目的基因Sygdh，在T4連接酶的作用下，與經(jīng)相同雙酶切的表達質(zhì)粒pET28a在16℃下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，獲得陽性重組菌，并送至上海Sangon公司測序，測序正確后命名該重組表達質(zhì)粒為pET28a-Sygdh。

1.5 重組SyGDH的誘導表達及純化

挑取陽性單菌落接種于2 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取300 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于30 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，向培養(yǎng)物中添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，于25℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，在4℃下，8 000 r/min離心收集菌體。菌體經(jīng)100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液洗滌兩次，稱取濕菌體2 g，加入15 mL上述緩沖液懸浮細胞，冰浴并超聲破碎（工作3 s，間隔8 s，工作時間30 min），15 000 r/min離心15 min，收集上清得粗酶液。粗酶液參照Ding[6]等的方法進行純化，得到重組葡萄糖脫氫酶 （SyGDH），用于SDS-PAGE分析。蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法，以牛血清白蛋白質(zhì)BSA為標準品。

1.6 重組SyGDH活力的測定

葡萄糖脫氫酶酶活力測定參照張等[5]的紫外分光光度計法，并略作修改?？偡磻w系為200 μL，分別加入終濃度為100 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液、2.0 mmol/L 的 NADP+、100 mmol/L 的 D-葡萄糖，37℃保溫2 min，加入適量純酶液，立即檢測1 min內(nèi)340 nm處吸光值的變化。酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘催化生成1 μmol的NADPH所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.7 產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯的測定

產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯檢測參照Park[14]等的氣相色譜法并略作修改：采用GC-2014型氣相色譜儀、Chirasil-Dex-CB手性色譜柱和氫火焰離子檢測器（FID）；檢測程序：進樣口溫度和檢測器溫度均為250℃，初始柱溫在80℃維持3 min，以4℃/min升溫梯度升溫至180℃維持2 min；載氣為氫氣，載氣體積流量為2.0 mL/min，分流比1∶50。底物4-氯乙酰乙酸乙酯和產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯的出峰時間分別為11.39 min和14.64 min。

1.8 重組SyGDH酶學性質(zhì)測定

1.8.1 最適反應pH及其穩(wěn)定性 在37℃條件下，按照1.6酶活力測定方法測定重組SyGDH在不同pH值下 （100 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH 3.0～8.0），100 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液 （pH 8.5～10.5），pH值間隔為0.5）的相對酶活性，以最高相對酶活性所對應的pH值定為重組SyGDH的最適反應pH。將純化后重組SyGDH分別置于不同pH的緩沖液（同上）中，于40℃保溫1 h后，按照1.6的方法測定殘余酶活性，計未處理酶的酶活性為100%，當殘余酶活力達到80%以上，即定義為穩(wěn)定，從而確定重組SyGDH的pH穩(wěn)定性。

1.8.2 最適反應溫度及其穩(wěn)定性 在最適反應pH下，按照1.6的方法測定在不同溫度下（30～80℃，溫度間隔為10℃）的相對酶活性，以最高相對酶活性所對應的溫度定為重組SyGDH的最適反應溫度。將純化后重組SyGDH分別置于不同溫度（30～80℃，溫度間隔為5℃）下保溫1 h后，按照1.6的方法測定殘余酶活性，計未處理酶的酶活性為100%，當殘余酶活力達到80%以上，即定義為穩(wěn)定，從而確定重組SyGDH的溫度穩(wěn)定性。

1.8.3 金屬離子和EDTA對重組SyGDH酶活性的影響 將純化后重組SyGDH與不同金屬離子或EDTA溶液（終濃度為 2.0 mmol/L）混合，于40℃保溫1 h，按1.6的方法測定殘余酶活性。計同樣條件下只加緩沖液處理的酶的活性為100%，當殘余酶活力為80%以下，即定義為有抑制作用，以此來衡量所測金屬離子和EDTA對重組SyGDH酶活性的影響。

1.8.4 輔酶的依賴性 根據(jù)1.6中方法，以100 mmol/L的D-葡萄糖為底物，分別以NAD+和NADP+為輔酶，在不同輔酶濃度（2.0～100 mmol/L）下測定重組SyGDH的酶活性。采用Origin 8.0軟件進行非線性擬合，計算重組SyGDH對不同輔酶的動力學參數(shù)，以確定其對不同輔酶的親和力，從而確定重組SyGDH對輔酶的依賴性。

1.8.5 有機溶劑穩(wěn)定性 將純化后重組SyGDH與等體積的不同有機溶劑（二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、苯乙酮、丙酮、乳酸乙酯、石油醚、乙酸乙酯、正辛烷、正己烷、環(huán)己烷、異丙醇、正戊醇、正丁醇、乙醇、甲醇）混合，于37℃、200 r/min的搖床中振蕩1 h，按照1.6中方法測定殘余酶活性，計同樣條件下只加緩沖液處理的酶的活性為100%，當殘余酶活力為50%以下，即定義為有機溶劑對酶有明顯抑制作用，以此來衡量重組SyGDH對所測不同有機溶劑的耐受性。

1.8.6 底物譜分析及動力學參數(shù) 按照1.6中方法，分別以D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、麥芽糖、蔗糖和D-葡萄糖為底物，測定重組SyGDH的相對酶活性，將最高相對酶活性所對應的底物定為最適底物。以不同濃度（0.5～5.0 mmol/L）的D-葡萄糖為底物，按照1.6中方法測定酶活力，采用Origin 8.0軟件進行非線性擬合，計算重組SyGDH對于D-葡萄糖的Km和Vmax值。

1.9 輔酶NADPH的再生驗證

按照1.5方法培養(yǎng)E.coli BL21/pET28a-S1，誘導表達重組羰基還原酶。偶聯(lián)輔酶再生反應體系：在 2 mL 磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L、pH 6.5） 中，加入0.1 g重組SyGDH濕菌體、0.1 g重組羰基還原酶濕菌體，含有終濃度100 mmol/L D-葡萄糖、2 mmol/L NADPH、4 mmol/L 4-氯乙酰乙酸乙酯；在37℃、220 r/min條件下反應10 h后，加入2 mL乙酸乙酯，充分振蕩混勻后，10 000 r/min離心10 min，取上層有機相，無水硫酸鎂干燥，過0.22 μm有機膜后用于氣相色譜檢測，分析產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯得率；同樣條件下，以0.2 g E.coli BL21/pET28a濕菌體代替雙菌作為陰性對照1；用0.2 g重組羰基還原酶濕菌體構(gòu)建單酶催化還原反應體系作為陰性對照2，測定產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜酸熱源體葡萄糖脫氫酶表達載體構(gòu)建

通過密碼子優(yōu)化后獲得重組質(zhì)粒pUCm-TSygdh，經(jīng)Nco I和Hind III雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見大小約為2 700 bp和1 100 bp的條帶，分別為線性化的pUCm-T和目的基因Sygdh（圖 1），與目的基因理論大小（1 121 bp） 相符。將Sygdh與同樣雙酶切的pET28a進行連接，轉(zhuǎn)化E.coli BL21。經(jīng)T7通用引物鑒定后，篩選得到陽性重組菌E.coli BL21/pET28a-Sygdh，測序結(jié)果與預期相符。對質(zhì)粒pET28a-Sygdh進行Nco I和Hind III雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析可見約1 100 bp的條帶，與理論大小相符（圖2）。優(yōu)化后的基因序列Sygdh已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KF739810。

圖1 pUCm-T-Sygdh的Nco I和Hind III雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Double digestion of pUCm-T-Sygdh by Nco I and Hind III

2.2 重組SyGDH的表達、鑒定和純化

重組菌E.coli BL21/pET28a-Sygdh和陰性菌E.coli BL21/pET28a，經(jīng)1.0 mmol/L的IPTG 于25℃誘導12 h后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，與對照E.coli BL21/pET28a相比 （圖3，泳道1），重組菌E.coli BL21/pET28a-Sygdh的表達產(chǎn)物在表觀相對分子質(zhì)量41.0 kDa處有明顯的蛋白質(zhì)條帶（圖3，泳道2）。利用Band Scan軟件分析SDS-PAGE電泳圖，重組菌中目標蛋白質(zhì)表達量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的32.0%。重組菌經(jīng)超聲破碎、離心獲得粗酶液，粗酶液經(jīng)鎳離子親和層析純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白質(zhì)為單一條帶（圖3，泳道3），并測得其比活性為4.5 U/mg，而E.coli BL21/pET28a中并未檢測到葡萄糖脫氫酶活性。結(jié)果表明，Sygdh基因在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效表達。

圖2 pET28a-Sygdh的Nco I和Hind III雙酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Double digestion of pET28a-Sygdh by Nco I and Hind III

圖3 重組SyGDH的SDS-PAGE分析圖Fig.3 SDS-PAGE Analysis of the recombinant SyGDH

2.3 重組SyGDH的酶學性質(zhì)

2.3.1 最適pH及其穩(wěn)定性 按照1.8.1中的方法測定酶的最適pH及pH穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4，重組SyGDH的最適pH值為7.5，當pH＜6.0或者pH＞7.5時，酶活力下降較快；該重組酶在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，在pH 6.0～8.0下孵育1 h后，殘余酶活力仍保持在80%以上。

圖4 pH值對重組SyGDH酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on the activity of the recombinant SyGDH

2.3.2 最適反應溫度及其穩(wěn)定性 按照1.8.2中的方法測定酶的最適反應溫度及其穩(wěn)定性，結(jié)果表明該酶在30～50℃范圍內(nèi)催化活性較高，最適反應溫度為40℃，見圖5（a）；在55℃以下穩(wěn)定，在該溫度下處理1 h殘余酶活力仍能達到98.0%以上，該酶在60℃下處理1 h后，殘余酶活力為82.2%，見圖5（b），表明該酶在較高溫度下可長時間保持穩(wěn)定。

圖5 重組SyGDH的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.5 Optimal temperature and thermostability of the recombinant SyGDH

2.3.3 金屬離子和EDTA對重組SyGDH的影響所測不同金屬離子及EDTA對重組SyGDH酶活性的影響如圖6所示。結(jié)果表明，Zn2+對該酶有明顯促進作用（相對酶活力＞115.0%），Cu2+有明顯的抑制作用（相對酶活力為50%），其他金屬離子和EDTA對該酶的活性影響不大。

圖6 金屬離子和ETDA對重組SyGDH酶活的影響Fig.6 Effects of various metal ions and ETDA on the activity of the recombinant SyGDH

2.3.4 輔酶依賴性 利用Origin 8.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行非線性擬合，得到重組SyGDH對兩種輔酶的動力學參數(shù)：該酶催化NADP+的Vmax（14.9 U/mg）小于催化NAD+的Vmax（25.7 U/mg），但該酶催化NADP+的Km值為4.6 mmol/L，明顯低于催化NAD+的 Km（157.9 mmol/L），且催化 NADP+的 Kcat/Km值為2 213.2 L/（s·mmol），是催化 NAD+的 20 倍。 結(jié)果表明，重組SyGDH為NAD+、NADP+雙輔酶依賴型葡萄糖脫氫酶，且該酶對NADP+有較強的親和力。

2.3.5 有機溶劑耐受性 有機溶劑對重組SyGDH活力影響結(jié)果如圖7所示，重組SyGDH在丙酮、異丙醇中放置1 h后，酶活力仍保持在90%以上；在乙醇、二甲基甲酰胺、正辛烷、甲醇、石油醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯中的殘留酶活力都在50%以上；在苯乙酮、正丁醇、正戊醇、二甲基亞砜中1 h后的殘留酶活較低，分別為 48.3%、48.0%、39.0%、35.1%，說明該酶對部分有機溶劑具有耐受性。

2.3.6 底物譜分析及動力學參數(shù) 葡萄糖脫氫酶的底物譜分析結(jié)果顯示，重組SyGDH對D-半乳糖（D-葡萄糖C4的差相異構(gòu)體）的催化活性是D-葡萄糖催化活性的90.3%，而對其他底物均未檢測到活性。這一結(jié)果與Angelov[15]報道的具有雙底物特異性的葡萄糖/半乳糖脫氫酶的性質(zhì)相似。重組SyGDH對D-葡萄糖的Km和Vmax值分別為28.2 mmol/L和 6.5 U/mg。

圖7 有機溶劑對重組SyGDH酶活力的影響Fig.7 Effects of organic solvents on the recombinant SyGDH activity

2.4 輔酶NADPH的再生驗證

利用重組SyGDH和重組羰基還原酶構(gòu)建偶聯(lián)輔酶再生體系。結(jié)果表明：陰性對照1，見圖8（a），未能檢測到產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯；陰性對照2，見圖 8（b），檢測到產(chǎn)物的產(chǎn)率為 31.8%；偶聯(lián)輔酶再生體系，見圖8（c），檢測到產(chǎn)物的產(chǎn)率達到99.0%，是未添加重組SyGDH（陰性對照2）時產(chǎn)物產(chǎn)率的3.11倍。驗證了重組SyGDH具有為生物催化氧化還原反應提供輔酶NADPH再生的能力。

圖8 產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯產(chǎn)率的氣相色譜圖Fig.8 Yield of ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate determined by GC

3 結(jié)語

由于耐有機溶劑葡萄糖脫氫酶在生物催化中具有重要的應用價值，通過基因工程實現(xiàn)葡萄糖脫氫酶異源高效表達是降低其工業(yè)應用成本、適應工業(yè)應用的有效手段[16]。作者成功實現(xiàn)了嗜酸熱源體中葡萄糖脫氫酶基因Sygdh在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中表達。酶學性質(zhì)研究表明，重組SyGDH的耐有機性和耐高溫性與Smith[7]等分離得到的野生型葡萄糖脫氫酶一致，與Zhang[5]等和Ding[6]等克隆的葡萄糖脫氫酶相比，其熱穩(wěn)定性和耐有機溶劑性質(zhì)均較好，具有適合于工業(yè)應用的理想特性。在構(gòu)建重組葡萄糖脫氫酶與羰基還原酶偶聯(lián)輔酶再生體系中，添加重組SyGDH時產(chǎn)物4-氯-3-羥基丁酸乙酯的產(chǎn)率達到99.0%，是未添加重組SyGDH時產(chǎn)物產(chǎn)率的3.11倍，表明重組SyGDH能為生物催化氧化還原反應提供輔酶NADPH的再生。同時，本研究也為解決有機溶劑中生物催化氧化還原反應輔酶限制問題奠定了良好的基礎(chǔ)。

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