劉旭梅， 李 恒， 蔣 敏， 龔勁松， 許正宏， 史勁松

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

近年來，隨著海洋生物功能性食品開發(fā)、海洋藥物研制等領域的發(fā)展，褐藻膠裂解酶的研究引起了研究者的重視和關注。褐藻膠裂解酶具有廣泛的生物來源，可從多種海洋微生物、土壤微生物、噬菌體、病毒、海洋軟體動物和海藻中分離得到，其中以海洋微生物的來源為主[1]。在目前已報道的多種褐藻膠裂解酶中，主要來源于弧菌（Vibrio）[2]，假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[3]，固氮菌（Azotobacter vinelandii）[4]、 交 替 假 單 胞 菌 （Pseudoaltermonas elyakovii）[5]及交替單胞菌（Alteromonas）[6]等。 海藻酸鈉又名褐藻酸鈉、褐藻膠，是一種由L-古羅糖醛酸和其C5差向異構體D-甘露糖醛酸結合而成的線性高分子多糖。褐藻膠裂解酶通過β-消去機制催化褐藻膠降解產生具有多種生物活性的褐藻寡糖[7]。由于褐藻膠裂解酶具有專一性、反應效率高、反應溫和及可控性強等優(yōu)點，被認為是定向制備褐藻寡糖的有力工具。因此，不斷尋找開發(fā)新的高效褐藻膠裂解酶，并用于實現海藻膠高值應用，是現階段的主要研究趨勢和熱點。

據報道，大部分褐藻膠裂解酶是一種可誘導性酶，通過改變其培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件可以提高微生物的產酶量。本研究以褐藻酸鈉作為唯一碳源，從腐爛的海帶中篩選到一株高產褐藻膠裂解酶的菌株，通過形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析對其鑒定，并采用單因素和正交試驗方法對產酶條件優(yōu)化，為褐藻膠裂解酶的工業(yè)化應用提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源 腐爛的海帶，來源于連云港中大海藻工業(yè)有限公司，置于低溫保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）富集和初篩培養(yǎng)基 （g/L）：褐藻酸鈉 5.0，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO41.0，（NH4）2SO45，瓊脂 18，NaCl 30；pH 7.0。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 5.0，酵母粉 1.0，褐藻酸鈉 5.0，NaCl 30；pH 7.0。

1.1.3 主要試劑及儀器 PCR產物回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司；實驗中用于擴增及克隆所用試劑，均購自Takara公司；蛋白胨，購自上海生工公司；其他試劑均購自國藥試劑公司。

PCR擴增儀，Bio-Rad公司制造；UV-2100型分光光度計，上海尤尼科儀器有限公司制造；核酸電泳系統(tǒng)，COSMO BIO Co-LTD制造；精密pH計，上海Mettler-Toledo制造。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的篩選 將樣品涂布到以褐藻酸鈉為唯一碳源的固體平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)，選取生長良好且具有透明水解圈的菌株，接種到篩選液體培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)，測定發(fā)酵上清液中的酶活力。

1.2.2 細菌的形態(tài)結構觀察 固體平板培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)，經質量分數2%乙酸固定脫鹽后采用革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 16S rDNA的克隆與序列分析 菌株WG-007基因組采用細菌基因組試劑盒進行提取，質粒提取采用堿裂解法，參照文獻進行感受態(tài)制備、連接、轉化等[8]。以WG-007菌株基因組DNA為模板，利用通用引物 （5'-ATTCCGGTTGATCCTGC-3’；5-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3’）擴增 16S rDNA，PCR 條件為：94℃變性 45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，30個循環(huán)，72℃延伸 10 min[9]，擴增產物通過質量分數1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物連接pMD19-T載體，轉化 Escherichia coli JM109。將克隆后的樣品進行測序，測序結果在GenBank中進行BLAST序列比對以確定種屬。遵循鄰接法和最大相似法原則，應用 CLUSTAL、MEGA5.0等軟件進行聚類與同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。

1.2.4 生理生化試驗 將菌株WG-007涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察細胞形態(tài)和菌落特征。部分生理生化試驗鑒定參照《常用細菌鑒定手冊》[11]。

1.3 褐藻膠裂解酶活力的測定方法

取一定體積的發(fā)酵液在4℃，8 000 r/min條件下離心20 min，取上清液測定酶活力。一定體積的發(fā)酵上清液與1 mL質量分數1%褐藻酸鈉溶液（0.05 mol/L、pH 7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制）混合，45℃反應15 min后，迅速加入1 mL DNS溶液于沸水浴3 min后迅速冷卻，然后定容到10 mL，用紫外分光光度計于520 nm下測定吸光值。

1個酶活力單位（U）定義為：1 mL酶液在上述條件下反應，每分鐘產生1 μg還原糖所需要的酶量[12]。

1.4 菌株的發(fā)酵優(yōu)化

除非特別說明，以篩選液體培養(yǎng)基作為出發(fā)培養(yǎng)基，優(yōu)化結果用于后續(xù)試驗。順序開展碳源的選擇及最佳濃度、氮源的選擇及最佳濃度、NaCl及無機鹽的濃度等研究。在單因素實驗的基礎上選取褐藻酸鈉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4進行四因素三水平正交試驗，確定最佳培養(yǎng)基組成。在最佳培養(yǎng)基組成下，分別對培養(yǎng)基的pH、轉速、培養(yǎng)溫度、裝液量、接種量進行優(yōu)化，檢測不同培養(yǎng)條件對菌株產酶能力的影響。

2 結果與討論

2.1 分泌褐藻膠裂解酶菌株的篩選

通過初篩培養(yǎng)，篩選出8株能在以褐藻酸鈉為唯一碳源的平板上生長且形成透明水解圈的菌株，通過發(fā)酵培養(yǎng)，取上清液測定酶活，不同菌株酶活力的比較結果見圖1。編號為07的菌株發(fā)酵液酶活力最高，并且經5代遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)其產酶穩(wěn)定，將此菌株命名為WG-007，并作為后續(xù)試驗的研究對象。

圖1 不同菌株的褐藻膠裂解酶活性Fig.1 Alginate lyase activity of different strains

2.2 菌株WG-007的鑒定

2.2.1 生理生化及形態(tài)學鑒定 菌株WG-007在初篩平板上培養(yǎng)24 h后菌落呈現圓形，直徑約為2～3 mm，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，稍有隆起，顏色為米黃色，無孢子形成。鏡檢結果見圖 2（a）（1 000×），菌落形態(tài)見圖 2（b）。

圖2 菌株WG-007形態(tài)學特征Fig.2 Morphological characterization of strain WG-007

菌株 WG-007可在 20～45℃，pH 5.5～10.0的條件下生長，最適溫度為25℃，最適pH為8.5。最高能夠耐受30 g/dL的NaCl溶液，在7.0 g/dL的NaCl溶液中生長最旺盛。其余生理生化特性如表1所示。

表1 菌株Cobetia sp.WG-007的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain Cobetia sp.WG-007

2.2.2 分子生物學鑒定 菌株WG-007的16S rDNA基因序列 1 507 bp （GenBank登錄號：KF545599）。經比對，發(fā)現其16S rDNA序列與Cobetia屬的多種菌株的相似性為99%。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。同時結合菌株的形態(tài)學特征和生理生化特征，將其鑒定為Cobetia屬，并命名為Cobetia sp.WG-007。

圖3 菌株WG-007的16S rDNA比對分析Fig.3 16S rDNA Blast analysis of strain WG-007

2.3 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

2.3.1 碳源和氮源對產酶的影響 將葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、褐藻酸鈉、淀粉等分別作為菌株Cobetia sp.WG-007生長的唯一碳源，研究不同碳源對菌株WG-007產酶的影響。結果表明，只有以褐藻酸鈉為唯一碳源時，才能在發(fā)酵液中檢測到酶活性，表明菌株WG-007所產的褐藻膠裂解酶屬于誘導酶。在此基礎上，進一步研究了不同質量濃度的褐藻酸鈉對菌株WG-007產酶的影響。如圖4所示，隨著褐藻酸鈉質量濃度的增加，菌株的產酶量也在增加，但是當質量濃度超過6 g/L時，菌株的產酶量反而逐漸下降，這可能是由于高濃度的褐藻酸鈉產生了一定的阻遏作用而影響了酶的生成。因此褐藻酸鈉適宜質量濃度為6 g/L。

圖4 褐藻酸鈉質量濃度對Cobetia sp.WG-007生長及酶活性的影響Fig.4 Effect of sodium alginate concentration on growth and enzyme activity from Cobetia sp.WG-007

進一步考察了WG-007在不同無機和有機氮源中的生長和產酶情況，發(fā)現在無機氮源（硫酸銨、氯化銨、草酸銨）中菌株生長緩慢且酶活性極低，而在有機氮源（包括蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等）中能檢測出一定酶活。其中以蛋白胨為氮源時，發(fā)酵液中酶活性較高。不同質量濃度的蛋白胨對菌株的生長及產酶結果見圖5，當蛋白胨質量濃度為4.0 g/L時，酶活達到最高。質量濃度過大同樣會影響褐藻膠裂解酶的積累。

圖5 蛋白胨質量濃度對Cobetia sp.WG-007生長及產酶的影響Fig.5 Effect of peptone concentration on growth and enzyme activity from Cobetia sp.WG-007

2.3.2 NaCl及金屬離子對產酶的影響 不同質量濃度的NaCl對菌株WG-007的生長和產酶均有明顯的影響，這與菌株來源于海洋環(huán)境有關。該菌株在低質量濃度的NaCl環(huán)境下生長緩慢，產酶能力低，在一定范圍內，隨著NaCl質量濃度的增加酶活力增加，當NaCl質量濃度為25 g/L時，菌株產酶能力最強，結果見圖6。實驗中還研究了不同種類的金屬離子對菌株 WG-007的生長和產酶的影響 （見表2）。結果顯示，只有K+表現為明顯的促進作用，其余幾種金屬離子均表現出不同程度的抑制。通過對K2HPO4質量濃度的優(yōu)化，表明質量濃度在0.25 g/L時，該菌株產酶能力最好，結果見圖7。

圖6 NaCl質量濃度對Cobetia sp.WG-007生長及產酶的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration on growth and enzyme activity from Cobetia sp.WG-007

表2 不同金屬離子對酶的作用Table 2 Effects of different metal ions on alginate lyase

圖7 K2HPO4的質量濃度對Cobetia sp.WG-007生長及產酶的影響Fig.7 Effect of K2HPO4concentration on growth and enzyme activity from Cobetia sp.WG-007

2.3.3 正交試驗結果 利用正交試驗綜合考察碳源、氮源等不同因素與水平對產酶的交互影響。單因素試驗已確定出對該菌株產酶影響較為突出的因素有褐藻酸鈉、蛋白胨、NaCl及K2HPO4質量濃度，因此選擇進行四因素三水平的正交試驗，設計見表3。

表 3 發(fā)酵優(yōu)化 L9（34）正交表Table 3 Fermentation optimization orthogonal L9（34）

結果顯示，進行的9組試驗中，第6組試驗（褐藻酸鈉 6.0 g/L， 蛋白胨 5.0 g/L，NaCl 20.0 g/L，K2HPO40.25 g/L）的酶活最高，達到128.7 U/mL。根據極差和方差分析（表4），可知正交試驗所考察的影響酶活力的4個因素中，主要因素是A（褐藻酸鈉質量濃度），其次是B（蛋白胨質量濃度）。通過正交試驗，酶活性提高幅度約為20%。

表4 發(fā)酵優(yōu)化L9（34）正交實驗直觀分析表Table 4 Orthogonal experiment and range analyasis of optimal fermentation

2.3.4 pH對產酶的影響 培養(yǎng)基初始pH對菌株產酶也具有重要影響，環(huán)境pH直接影響著細胞膜的活性、穩(wěn)定性以及產物代謝酶系的活性，從而間接影響著微生物對營養(yǎng)物質的吸收和酶的分泌[13]。如圖8所示，菌株WG-007產酶最適pH為8.5。

圖8 pH對Cobetia sp.WG-007生長及產酶的影響Fig.8 Effect of pH on growth and enzyme activity from Cobetia sp.WG-007

2.3.5 溫度對產酶的影響 在低于25℃時，菌株WG-007生長非常緩慢，直接影響到產酶。選擇25、28、30、37℃發(fā)酵培養(yǎng)，確定其產酶的最適溫度，結果如圖9所示，在25℃時酶活性最高，在較高溫度下菌株生長能力減弱，并且其產酶能力明顯下降。相關研究也顯示，大部分來源于海洋環(huán)境的褐藻膠降解菌產酶的適宜溫度范圍為25～30℃[14-15]。

2.3.6 裝液量、接種量、轉速對產酶的影響 不同的接種量對酶活性的影響并不顯著，當接種量達到體積分數2.0%時，就能夠達到較高的酶活。裝液量也是制約菌種生長及產酶的一個重要因素，裝液量過大會影響菌株生長過程中的溶氧，導致產酶下降。實驗發(fā)現，裝液量為30 mL時，褐藻膠裂解酶活力最高。試驗中還測定了不同的轉速 （150 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min） 對菌株 WG-007 產酶的影響。發(fā)現轉速對生長及產酶作用并不明顯，適宜轉速為150～180 r/min。

圖9 溫度對Cobetia sp.WG-007生長及產酶的影響Fig.9 Effect of temperature on growth and enzyme activity from Cobetia sp.WG-007

2.3.7 菌株WG-007的發(fā)酵產酶曲線 在最佳培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件下，菌株WG-007的生長和產酶隨時間的變化如圖10所示。生物量在21 h達到最大，發(fā)酵液中總酶活在30 h達到最高，為160.7 U/mL。依據酶發(fā)酵動力學曲線，該菌株產褐藻膠裂解酶屬于生長半耦聯型。

圖10 Cobetia sp.WG-007的生長曲線及產酶曲線Fig.10 Curve of growth and enzyme activity of Cobetia sp.WG-007

3 結語

由褐藻酸鈉作為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從腐爛海帶上篩選出多株具有明顯降解褐藻酸鈉能力的菌株，經過液體發(fā)酵培養(yǎng)基復篩，得到一株高產褐藻膠裂解酶的菌株WG-007。通過形態(tài)學研究并結合16S rDNA同源分析，鑒定該菌為Cobetia屬。鑒于目前未見有關Cobetia屬菌株產褐藻膠裂解酶的研究報道，因而研究Cobetia sp.WG-007產褐藻膠裂解酶具有一定的理論與應用價值。研究中通過單因素及正交試驗對該菌株產酶條件發(fā)酵優(yōu)化，已將酶活力提高到初始的3.52倍，達到160.7U/mL，接近了目前褐藻酸裂解酶發(fā)酵產酶的最高水平。由于優(yōu)化后的產酶培養(yǎng)基成分簡單，培養(yǎng)周期短，因此Cobetia sp.WG-007是一株潛在的可用于工業(yè)化生產的褐藻膠裂解酶生產新菌株。

[1]李麗妍，管華詩，江曉路，等.海藻工具酶——褐藻膠裂解酶研究進展[J].生物工程學報，2011，27（6）：838-845.LI Liyan，GUAN Huashi，JIANG Xiaolu，et al.Advances in algae toolenzymes：alginate lyase [J].Chinese Journal of Biotechnology，2011，27（6）：838-845.（in Chinese）

[2]Tang J C，Taniguchi H，Chu H，et al.Isolation and characterization of alginate-degrading bacteria for disposal of seaweed wastes[J].Letters in Applied Microbiology，2009，48（1）：38-43.（in Chinese）

[3]Farrell E K，Tipton P A.Functional characterization of algL，an alginate lyase from pseudomonas aeruginosa[J].Biochemistry，2012，51（51）：10259-10266.

[4]Gimmestad M，Ertesvag H，Heggeset T M B，et al.Characterization of three new azotobacter vinelandii alginate lyases，one of which is involved in cyst germination[J].Journal of Bacteriology，2009，191（15）：4845-4853.

[5]Ma L Y，Chi Z M，Li J，et al.Overexpression of alginate lyase of Pseudoaltetmonas elyakovii in Escherichia coli，purification，and characterization of the recombinant alginate lyase[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（1）：89-96.

[6]Math R K，Jin H M，Kim J M，et al.Comparative genomics reveals adaptation by Alteromonas sp.SN2 to marine tidal-flat conditions：Cold tolerance and aromatic hydrocarbon metabolism[J].PloS One，2012，7（4）：e35784.

[7]Haug A，Myklestad S，Larsen B，et al.Correlation between chemical structure and physical properties of alginates[J].Acta Chemica Scandinavica，1967，21：768-78.

[8]Di Cello F，Bevivino A，Chiarini L，et al.Biodiversity of a Burkholderia cepacia population isolated from the maize rhizosphere at different plant growth stages[J].Applied and Environment Microbiology，1997，63（11）：4485-4493.

[9]Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of Bacteriology，1991，173（2）：697-703.

[10]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[11]東秀珠，蔡妙英.一般細菌常用鑒定方法[M].北京：科學出版社，2001.

[12]魏丹，竇文芳，李恒，等.高效降解褐藻膠新菌種的篩選、鑒定及產酶條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（7）：26-31.WEI Dan，DOU Wenfang，LI Heng.et al.Isolation，identification，and fermentation optimization of a high efficient novel alginatedegrading strain[J].Food and Fermentation Industries，2012，38（7）：26-31.（in Chinese）

[13]侯保兵，劉書來，張建友，等.褐藻膠裂解酶產生菌的發(fā)酵優(yōu)化研究[J].水產科學，2009，28（11）：667-670.HOU Baobing，LIU Shulai，ZHANG Jianyou，et al.Optimization of alginate-degrading bacterial fermentation process for alginate lyase production[J].Fisheries Science，2009，28（11）：667-670.（in Chinese）

[14]傅曉妍，李京寶，韓峰，等.褐藻膠裂解產生菌Vibro sp.QY102的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國海洋大學學報，2007，37（3）：432-436.FU Xiaoyan，LI Jingbao，HAN Feng.et al.Studies on Vibro sp.QY102 fermentation processes for alginate lyase production[J].Periodical of Ocean University of China，2007，37（3）：432-436.（in Chinese）

[15]Fu X，Lin H，Kim S M.Optimization of culturing condition and medium composition for the production of alginate lyase by a marine Vibrio sp.YKW-34[J].Journal of Ocean University of China，2008，7（1）：97-102.