劉 箐， 陳國薇， 張 超， 吳 嫚， 李 森， 吳淑燕， 董慶利

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

重金屬污染是我國工業(yè)化發(fā)展面臨的最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一，主要是汞、鎘、鉻、鉛及砷等具有嚴(yán)重生物毒性的一系列重金屬元素及其化合物，對環(huán)境造成不可逆的長期污染。重金屬最常見的污染途徑，首先是污染大氣、水體及土壤，再經(jīng)過生物鏈的富集或飲用水進(jìn)入人體，這些重金屬及其衍生物進(jìn)入人體后，會引起氧化應(yīng)激、損傷生物大分子，進(jìn)而對人體帶來致癌、致畸、致突變等嚴(yán)重后果。重金屬污染難以被自然生態(tài)自主修復(fù)，加上生物鏈對重金屬的富集作用，所以對環(huán)境中所有的生物物種的生存、生態(tài)環(huán)境平衡等，具有長期的惡性影響，是全世界尤其是新興工業(yè)化國家必須長期面對的、最嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。

重金屬主要通過口腔、呼吸道和皮膚3種途徑進(jìn)入人體，進(jìn)入人體后便不再以離子的形式存在，而是與體內(nèi)有機(jī)成分結(jié)合成金屬絡(luò)合物或金屬螯合物[1]。重金屬進(jìn)入人體后，會和蛋白質(zhì)及酶類發(fā)生螯合作用，引起蛋白質(zhì)內(nèi)層疏水基團(tuán)外露，從而使其相互聚集，最終引發(fā)蛋白質(zhì)的聚沉。之前日本爆發(fā)的水俁?。ü廴荆┖凸峭床。ㄦk污染），就是由于重金屬污染[2]。由此可見，重金屬污染對人體的傷害是非常嚴(yán)重的，并且這種傷害是持久的。重金屬污染嚴(yán)重影響了人們的正常生活，甚至?xí)ο乱淮慕】诞a(chǎn)生危害。因此，重金屬的檢測顯得尤為重要，只有能夠及時(shí)準(zhǔn)確地檢測出重金屬含量，才能將污染對人類健康的危害降到最低。

對于無法自主修復(fù)、無法清除的重金屬污染，進(jìn)行飲用水、農(nóng)產(chǎn)品、食品的檢測，成為控制人體攝入重金屬的最后一道屏障。重金屬的檢測自研究起，多采取物理化學(xué)方法，如原子吸收光譜（ASS）法[3-5]、電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-AES）[6-8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[9-10]、高效液相色譜法[11-12]等，這些方法檢測靈敏、準(zhǔn)確度高，有些可以同時(shí)檢測多種樣品，但是尚有以下不足：比如必須依賴大型設(shè)備、樣品前處理繁瑣、檢測周期較長、對技術(shù)人員要求高、檢測成本較高、無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測等。近幾年，以生物技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合納米技術(shù)、傳感技術(shù)、光電技術(shù)等交叉學(xué)科，對重金屬的快速、簡便檢測提供了可能。這些技術(shù)操作簡便，僅需要小型設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)室及技術(shù)人員要求低，檢測成本低，且可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測。本文中重點(diǎn)介紹酶分析法、免疫分析法、生物傳感器以及生物結(jié)合技術(shù)等基于生命科學(xué)理論和方法的重金屬檢測技術(shù)，并對其優(yōu)缺點(diǎn)及未來發(fā)展前景予以綜合敘述評論。

1 酶分析法

酶分析法是根據(jù)重金屬離子能夠與一些酶類結(jié)合，之后會引起酶類結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致酶活下降，最終根據(jù)產(chǎn)生的一系列可以分析的變化判定重金屬的含量。目前已經(jīng)有多種酶用于重金屬離子的測定，最常用的是脲酶[13]。

脲酶是一種含鎳的寡聚酶，以尿素酶失活為基礎(chǔ)的安培檢測已經(jīng)應(yīng)用于環(huán)境樣品中重金屬的檢測篩選。脲酶催化水解的尿素和形成NH4+影響NADH-谷氨酸脫氫酶的偶聯(lián)反應(yīng)體系。重金屬的存在下，樣品中的脲酶活性的抑制，導(dǎo)致產(chǎn)生較低的NH4+和NADH氧化少。2004年Rodriguez B B等[14]利用脲酶這一特性建立了測定重金屬的方法，對Hg2+和 Cu2+的檢測限分別為 0.007 2 μg/mL和0.008 5 μg/mL；對 Cd2+和 Zn2+的檢測限分別為0.000 3 μg/mL 和 0.000 2 μg/mL。 經(jīng)比較，脲酶靈敏度是較高的，這也是脲酶在酶分析法中應(yīng)用最為廣泛的原因。2006年Shukor等[15]的研究中利用木瓜蛋白酶作為主體，使用酪蛋白質(zhì)作為底物，考馬斯染料進(jìn)行示蹤，進(jìn)而表征木瓜蛋白酶水解酪蛋白質(zhì)的程度，進(jìn)而建立了一種重金屬檢測手段。此方法測定 Hg2+、Ag+、Pb2+、Zn2+的 IC50（具備 50%抑制毒性濃度） 值分別為 0.39、0.40、2.16 μg/mL 和 2.11 μg/mL。對于Cu2+和 Cd2+的Limit of Quantitation （LOQ 檢出限量）分別為4和100 μg/mL。菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶，2008年Shukor等[16]利用菠蘿蛋白酶，與木瓜蛋白酶測定方法類似，使用酪蛋白質(zhì)作為底物，使用考馬斯染料示蹤，測定菠蘿蛋白酶水解酪蛋白質(zhì)程度，進(jìn)而建立了一種測定重金屬的方法，最終檢測 Hg2+和 Cu2+的 IC50值分別為 0.15 μg/mL和0.23 μg/mL。此種方法主要就是利用不同酶類對不同的重金屬有著不同的靈敏度建立的一種方法?，F(xiàn)在的研究中主要使用一些蛋白酶和脲酶，這些酶使用較普遍并且對金屬離子有著較好的親和力，最終檢測結(jié)果也由于不同的酶以及親和力的差異而有較大的差別。2011年Hu等[17]的研究中，使用紫外線處理過的液晶檢測在水相中重金屬的新方法，脲素水解產(chǎn)物可以誘導(dǎo)液晶的取向轉(zhuǎn)變，通過傳感器研究其光學(xué)信息，進(jìn)而應(yīng)用于檢測Cu2+，檢測限低于10 μg/mL。

酶分析法在重金屬檢測中得到較好的應(yīng)用，檢測限也較低，并且操作比較簡單。但是還存在一些不足，首先酶的活性影響因素比較多，所以在檢測過程中容易干擾酶的活性，從而影響最終重金屬測量的結(jié)果。并且酶分析法的特異性較低，該方法側(cè)重重金屬總含量，而對于其中某種重金屬的含量無法準(zhǔn)確測定。目前，可應(yīng)用的酶類較少，相對于光譜分析法來說，光譜分析法可檢測的重金屬種類更多一些。

2 免疫分析法

免疫分析法（Immunoassay）是一種根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，利用已知的抗原檢測未知抗體或利用已知的抗體檢測未知抗原的方法。由于重金屬離子沒有免疫原性，不能直接產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以使用免疫分析法分析重金屬離子首先必須選擇合適的化合物與重金屬離子結(jié)合，使其產(chǎn)生反應(yīng)原性，即抗原性，進(jìn)而將此復(fù)合物連接到載體蛋白質(zhì)上，產(chǎn)生免疫原性。完成這兩步工作后，即可根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行含量的測定，其中連接重金屬和載體蛋白質(zhì)的化合物是最重要的因素。

競爭免疫測定一般是在微孔模式下進(jìn)行，2001年Blake等[18]用一種計(jì)算機(jī)控制的流式熒光計(jì)（KinExA）替代之前使用的微孔模式，抗體在KinExA格式下能以水溶性金屬螯合物進(jìn)行預(yù)平衡，然后這種螯合物能夠迅速通過并且使之固定化。使用這種方法顯現(xiàn)出很好的靈敏度，檢測樣品中的Cd2+，Co2+，U6+和 Pb2+，平均鎘（II）的回收率（114.25+11.37）%，批內(nèi)和批間精密度變異系數(shù)分別為0.81%～7.77%和3.62%～14.16%。2001年Darwish等[19]建立的方法是酶結(jié)合物和Cd2+-EDTA之間競爭固定化抗體的結(jié)合位點(diǎn)，單克隆抗體用來識別Cd2+-EDTA配合物。通過顏色變化表征EDTA配合物抑制酶結(jié)合物的能力，從而確定水樣中Cd2+的質(zhì)量濃度，其對Cd2+的檢出限為 0.3×10-9g/mL。2012 年 Wang 等[20]選取6-巰基丙酸（MNA）作為雙功能配體，利用其結(jié)構(gòu)上帶有羧基和巰基吡啶環(huán)，從而能夠很好地和Hg2+和蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。然后，使用全抗原免疫小鼠Balb/c小鼠激發(fā)免疫學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而制備單克隆抗體。通過脾細(xì)胞和Sp2/c細(xì)胞融合獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），從而實(shí)現(xiàn)對樣品Hg2+的檢測；根據(jù)ELISA和Hg2+的關(guān)系建立了質(zhì)量濃度從0.1～100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而測得IC50和LOD值分別為1.12 ng/mL和0.08 ng/mL。這些方法都是基于抗原抗體特異性結(jié)合的特性，選擇合適的化合物再與重金屬離子進(jìn)行連接，過程相對比較復(fù)雜，但是特異性較好?？傊?，不同的重金屬離子與不同的配體化合物的結(jié)合是不同的，所以只有針對不同的重金屬離子進(jìn)行不同配體的挑選，才能更好地提高檢測靈敏度。

近幾年，免疫膠體金快速檢測應(yīng)用于很多領(lǐng)域，以其檢測便攜快速為長。膠體金是由氯金酸在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，即為膠體金。此方法是利用膠體金作為示蹤物的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。2009年及2011年，Kaoru Abe[21-22]等利用膠體金技術(shù)成功建立了對水稻、土壤和小麥、茄子中的重金屬鎘的免疫學(xué)檢測方法，為實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2010年Tang[23]等成功制備了Pb2+的膠體金快速檢測卡，檢測限達(dá)到50 ng/mL。膠體金免疫檢測技術(shù)是一種非常適合現(xiàn)場檢測的技術(shù)，并且對于液體的重金屬檢測更加簡便，省去了樣品處理的過程。此方法檢測所需儀器小，能夠更好地實(shí)現(xiàn)便攜性，提高檢測效率。但是目前免疫檢測方法還不能取代傳統(tǒng)方法，僅作為輔助檢測方法使用。

3 生物技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合

近年來，生物技術(shù)與其他學(xué)科交叉產(chǎn)生的技術(shù)在重金屬檢測方面得到了較好的發(fā)展。生物技術(shù)特異性較好，反應(yīng)靈敏度高，但是由于本身重金屬離子缺乏生物性，并且生物反應(yīng)結(jié)果不能夠很直觀的表征，所以多與傳感器、納米材料及量子點(diǎn)等發(fā)展較為前端的科學(xué)進(jìn)行結(jié)合。這種交叉能夠更好地突出生物技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，又能通過其他技術(shù)彌補(bǔ)生物技術(shù)的不足。發(fā)展較為全面，研究較為深入的主要是與傳感器及納米材料技術(shù)的結(jié)合。

3.1 生物傳感器

生物傳感器是一種由固定化的生物敏感材料作為識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)）與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等）及信號放大裝置構(gòu)成的一種儀器，最終將其濃度轉(zhuǎn)化為電信號進(jìn)行監(jiān)控。此種方法主要為生物技術(shù)與物理學(xué)的交叉結(jié)合，以生物反應(yīng)為基礎(chǔ)，進(jìn)而結(jié)合物理信號，通過放大或處理進(jìn)行檢測。見表1。

表1 生物傳感器在重金屬檢測中的應(yīng)用Table 1 Application ofbiosensorsin heavy metal detection

生物傳感器檢測重金屬具有便攜性強(qiáng)、高通量、檢測快等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)在線連續(xù)檢測技術(shù)的應(yīng)用提供了可能，并且可以實(shí)現(xiàn)多種重金屬的檢測，檢測周期較短。但是，生物傳感器制作過程較為復(fù)雜，制作工藝較難，檢測成本高。未來發(fā)展生物傳感器檢測重金屬，加強(qiáng)其穩(wěn)定性和實(shí)現(xiàn)多種重金屬離子的檢測是值得多加關(guān)注的地方。

3.2 納米技術(shù)

與生物技術(shù)相結(jié)合的納米技術(shù)（Nanotechnology）應(yīng)用于多種檢測技術(shù)中，在重金屬檢測上也有了一定程度的應(yīng)用。主要有結(jié)合熒光量子點(diǎn)、金納米顆粒等檢測重金屬離子，具有高靈敏度、高選擇性、成本低、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。量子點(diǎn)（Quantum Dots），又稱半導(dǎo)體納米晶（Semiconductor Nano crystal），具有熒光強(qiáng)度高、發(fā)射峰較窄、抗光漂白性高、發(fā)射峰譜可控等優(yōu)點(diǎn)[28]。納米金即指金的微小顆粒，直徑在1～100 nm之間。納米金具有高電子密度、介電特性和催化作用等特性，并且能在不影響生物活性的前提下與多種大分子生物結(jié)合?；跓晒饬孔狱c(diǎn)和金納米顆粒的物理優(yōu)點(diǎn)，與生物技術(shù)相結(jié)合，在重金屬檢測中得到一定的應(yīng)用。量子點(diǎn)及金納米顆粒有著較好的生物相容性，可以與寡核苷酸片段、蛋白質(zhì)相結(jié)合，進(jìn)而通過其物理特性對重金屬離子檢測；也可以連接化學(xué)基團(tuán)，再通過化學(xué)基團(tuán)與蛋白質(zhì)等進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而檢測重金屬離子濃度。

2012年Hao等[29]在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的基礎(chǔ)上，利用Hg2+和Ag+能夠形成強(qiáng)而穩(wěn)定的THg2+-T、C-Ag+-C復(fù)合物，從而拉近供體Cd Te量子點(diǎn)和受體已標(biāo)記的寡核苷酸片段，使得能量從供體轉(zhuǎn)移到受體，轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生了熒光能量的改變，因此測得Hg2+和Ag+的含量。此實(shí)驗(yàn)在水介質(zhì)中檢測Hg2+和Ag+的檢出限分別為 1.8 nmol/L和2.5 nmol/L。增強(qiáng)量子點(diǎn)的熒光可以提高檢測靈敏度；2012年Chen[30]利用金納米粒子，在金納米粒子上連接巰基基團(tuán)，并且很據(jù)此基團(tuán)的特性再修飾上疊氮化物和炔烴化物，經(jīng)過這樣處理之后，金納米粒子的分散性得到了提高，并且較之前更加穩(wěn)定，最終能夠很好地檢測銅離子。他們在還原Cu2+成Cu+的方法上進(jìn)行了改進(jìn)，通過電極的還原作用，快速地產(chǎn)生Cu+，大大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間，并且視覺檢測限達(dá)到了1 nmol/L，提高了檢測的靈敏度。

利用納米技術(shù)與生物技術(shù)結(jié)合檢測重金屬，靈敏度高，特異性強(qiáng)，有望能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，可以對量子點(diǎn)及納米金進(jìn)行表面修飾，從而提高其特異性和穩(wěn)定性，并且為制備微型化的傳感器奠定了基礎(chǔ)。但是量子點(diǎn)制作過程比較復(fù)雜，量子點(diǎn)本身污染比較嚴(yán)重，多次使用會造成二次污染，且具有一定毒性。納米金顆粒保存時(shí)間比較短，易受到離子濃度和pH的影響，這些成為限制其發(fā)展的因素。目前該方法主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中還需要解決許多問題。

4 存在不足與發(fā)展方向

目前針對生物技術(shù)方法檢測重金屬還存在幾點(diǎn)不足：

1）食品重金屬檢測的樣品前期處理比較復(fù)雜與費(fèi)時(shí)，影響了食品重金屬檢測的發(fā)展，進(jìn)而使得生物檢測手段發(fā)展受到限制。

2）重金屬離子本身缺乏生物特性，需要結(jié)合其他化合物才能利用生物技術(shù)進(jìn)行檢測。

3）重金屬污染一般為多種重金屬離子導(dǎo)致，使用生物技術(shù)檢測一般針對其中某種重金屬離子或者總體，無法較快捷地一次性檢測出其中每種重金屬離子的濃度。

重金屬檢測方法種類多樣，傳統(tǒng)方法有需要繼續(xù)傳承的地方，也有需要進(jìn)一步改進(jìn)的地方。生物技術(shù)的使用，更大程度上提供了現(xiàn)場快速檢測的可能，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，克服一些生物技術(shù)檢測的不足，勢必會得到更大更好的發(fā)展。生物技術(shù)在重金屬檢測上的應(yīng)用也給其他檢測學(xué)科提供了新的思路，多方面學(xué)科綜合使用，將會實(shí)現(xiàn)許多檢測的現(xiàn)場快速應(yīng)用。

5 結(jié)語

生物技術(shù)近幾年在各個學(xué)科都有較快較好的發(fā)展，以其反應(yīng)快速、靈敏度高為長。在國內(nèi)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的同時(shí)，也衍生出很多污染及食品安全問題。生物技術(shù)給許多污染檢測帶來了更加便捷快速的檢驗(yàn)方法。綜合幾種生物技術(shù)方法，基本都是基于生物反應(yīng)為基礎(chǔ)的，再結(jié)合一些物理化學(xué)反應(yīng)原理進(jìn)行重金屬含量的檢測。生物反應(yīng)的特異性是應(yīng)用于重金屬檢測的一大優(yōu)勢，相對于較為傳統(tǒng)的方法，檢測精度得到了很大的提高。目前許多污染問題檢測周期比較長，并且很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，所以使得重金屬污染治理周期拉長，不能更好地解決環(huán)境問題，生物技術(shù)為現(xiàn)場快速檢測的實(shí)現(xiàn)提供了可能，目前已有較為成功的技術(shù)，如膠體金技術(shù)等應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測，大大縮短了檢測周期，并且經(jīng)濟(jì)成本得到了很大程度的降低。通過總結(jié)酶分析法、免疫分析法及生物傳感器等幾種生物方法，不難發(fā)現(xiàn)生物技術(shù)較大程度上提高了檢測的靈敏度，基本上不需要大型儀器，并且生物方法多種多樣，與其他學(xué)科結(jié)合，可以衍生出多種多樣的方法，加快了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的步伐。學(xué)科的交叉是創(chuàng)新的源泉，基于生物技術(shù)的檢測方法凸顯其特有優(yōu)勢，與其他學(xué)科的交叉將會使其得到更大的發(fā)展。

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