孫 田, 劉曉明, 張振穎

孢子絲菌病在世界范圍內(nèi)廣泛分布[1]，國內(nèi)各地均有本病的報(bào)道[2]。本病診斷目前主要依靠臨床表現(xiàn)及病原菌的分子生物學(xué)鑒定。孢子絲菌的相對特異性探針[3-5]為孢子絲菌病的分子生物學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)，但尚無資料對各探針進(jìn)行系統(tǒng)地比較。本研究旨在用聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫（PCR-ELISA）的方法在現(xiàn)有報(bào)道的探針種類中篩選出結(jié)合效率較高的孢子絲菌特異性探針，為快速、準(zhǔn)確的診斷孢子絲菌病提供臨床參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

來自不同地區(qū)和不同臨床分型孢子絲菌病的申克孢子絲菌50 株，其中大連37 株，上海5 株，北京4 株，長春2 株，南京1 株，美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)標(biāo)本(American type culture collection) 保存菌株ATCC10268 1 株（表1）。念珠菌、毛霉、煙曲霉各1 株，均為大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌室保存菌種。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑 基因組DNA 提取液CTAB [2%(W:V)十六烷基三甲基溴化物，100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA]，LA Taq 酶（5U/μl）購自大連寶生物工程有限公司，PCR-ELISA 試劑盒購自德國Roche 公司。

表1 50株孢子絲菌菌株的來源及臨床類型

1.2.2 基因組DNA 提取 將所有臨床分離株接種于SDA 液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)2 周，采用Graham 等[6]的CTAB 法提取真菌基因組DNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測DNA 含量。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增目的片段 以真菌通用引物NS1(18SrDNA 的部分堿基) 作為引物1 (5'-GTAGTC ATATGCTTGTCTC-3')，參照GeneBank 中5 株孢子絲菌核糖體保守區(qū)28SrDNA 3'端的基因序列設(shè)計(jì)引物2（5'-TTGGTCCGTGTTTCAAGACG-3'）；PCR 反 應(yīng)體 系：10×buffer 5 μl，dNTPs 4 μl，Taq 酶0.25 μl，各 菌 株DNA 1 μl(約70 ng)，引 物 各1 μl，dd H2O 37.75 μl；循環(huán)條件：96℃預(yù)變性1 min；95℃ 40's，52℃ 1 min，72 ℃ 2 min 擴(kuò)增30 個循環(huán)；最后一個循環(huán)后于72 ℃延伸7 min。產(chǎn)物鑒定：取5 μl 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，并取適量產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行純化測序，將測序結(jié)果在基因庫網(wǎng)上查詢，并用Clustal 軟件比較分析，擴(kuò)增出編碼核糖體（18S、5.8S、28SrRNA）及其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1、ITS2）的基因片段（圖1）。

圖1 引物和探針雜交位點(diǎn)示意圖

1.2.4 PCR-ELISA 合成一段以擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物片段內(nèi)ITS3 基因?yàn)榘邢虻奶结?，并以生物素?biāo)記，利用此探針結(jié)合上述DNA 片段使其固定在包被親和素的 96 孔板上（DNA 片段-探針*生物素---親和素-96 孔板），分別加入5 個地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，以底物顯色者記為陽性，記錄顯色與否、顯色強(qiáng)弱及酶標(biāo)儀讀取的吸光度（圖2）[3]?？晒┖Y選的孢子絲菌特異性探針序列[3,5,6]分別為針對28SrRNA 的 U26852：5'-Digoxigenin CGGACCACCCGGCG-3'；U26866：5'-Digoxigenin CGGCGGCATGCCCC-3'；U26866'：5'-Digoxigenin GTGGTCCGCGAGGCGCAA-3'；針 對18SrRNA 的M85053：5'-Digoxigenin GCGCTGCCAAAGCAACGC-3'；針對ITS2 區(qū)的AF117945：5'-Digoxigenin GACGCGCAGCTCTTTTTA-3'。用于與包被親和素的96 孔板結(jié)合的探針序列[3]為：ITS3-B：5'-Biotin GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'，合成于大連寶生物工程有限公司。雜交過程按PCR-ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。每孔讀取405 nm 波長下的吸光度（參考波長為492 nm），每兩個平行樣品的吸光度（A）值取平均數(shù)。A 值的修正：EI=A（待測DNA）/A（H2O）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各種探針的EI 值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間總的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗(yàn)（LSD 法），P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 PCR-ELISA原理示意圖

2 結(jié)果

2.1 PCR 產(chǎn)物的鑒定

以真菌通用引物NS1 和筆者自行設(shè)計(jì)的引物2對50 株孢子絲菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，均擴(kuò)增出編碼核糖體（18S、5.8S、28SrRNA）及其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1、ITS2）的基因片段約3 000 bp（圖3）。經(jīng)序列測定和比較，5 個待篩選探針及ITS3 探針的堿基序列均位于該DNA 片段上。

圖3 50株孢子絲菌18SrDNA-28SrDNA的PCR片段凝膠電泳圖

2.2 探針的結(jié)合效率檢測結(jié)果

在相同的雜交和ELISA 條件下，以ATCC10268為陽性對照，毛霉、煙曲霉、念珠菌各1 株為陰性對照，雙蒸滅菌水為空白對照，50 株孢子絲菌均對探針U26852 顯色較強(qiáng)，對其他4 個探針則顯色較弱。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，U26852 的EI=15.29±3.88，U26866 的EI=1.36±0.21，AF117945 的EI=1.12 ±0.12， M85053的EI=1.13 ±0.13， U26866'的EI=1.42±0.22，各組間總的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=650.317，P ＜0.05），組間兩兩比較顯示，U26852 的EI 值與其他4 個探針比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。毛霉、煙曲霉、念珠菌對5 個探針EI 值均偏低（0.97 ～1.02），雙蒸滅菌水為1。

3 討論

孢子絲菌的基因組DNA 由30 萬左右個堿基組成，確定各部位的功能已經(jīng)成為未來研究的方向和目標(biāo)。國內(nèi)外在基因診斷方面，目前側(cè)重于比較多種致病性真菌間的差異而尋找單一的探針和引物。由于真菌核糖體DNA（rDNA）基因的部分區(qū)域在進(jìn)化上高 度保守，而在其他區(qū)域又存在著足夠的變異，因此利用rDNA 基因進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Sandhu 和 Lindskey 等[3,4]通過與其他深部真菌和淺部真菌及細(xì)菌進(jìn)行對比，設(shè)計(jì)出針對18srRNA、28s rRNA、ITS2 區(qū)的孢子絲菌相對特異性探針，為孢子絲菌病的分子生物學(xué)診斷奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究首次對已報(bào)道的多種孢子絲菌特異性探針進(jìn)行篩選，以得到結(jié)合效率較高的探針。

1992 年Sano 等[7]首次報(bào)道了免疫PCR 技術(shù)，該方法將血清學(xué)中的抗原抗體反應(yīng)，與聚合酶鏈反應(yīng)特異擴(kuò)增一段DNA 分子的技術(shù)結(jié)合起來，用一段具體的DNA 分子標(biāo)記抗體去檢測抗原，PCR 擴(kuò)增此段DNA 分子，電泳定性，根據(jù)此段DNA 分子是否存在，來顯示抗原是否存在[8]。

Lindsley 等[3]將免疫PCR 方法進(jìn)行了改良，利用生物素與親和素之間強(qiáng)大的特異性結(jié)合原理，將PCR 產(chǎn)物借助生物素標(biāo)記的該片段探針結(jié)合到包被親和素的96 孔板上，同時加入地高辛抗原標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行雜交，反應(yīng)洗板后加入酶標(biāo)記的地高辛抗體和顯色底物，通過顯色強(qiáng)弱和酶標(biāo)儀測定吸光度值，成功地用特異性寡核酸探針快速鑒定了9 種雙相型和酵母樣真菌病原體。Elie 等和Fujita 等[9,10]通過免疫PCR 的方法應(yīng)用種特異性探針快速鑒定了念珠菌屬的部分菌種。朱利平等[11]用微孔板雙探針雜交法快速鑒別了都柏林念珠菌和白念珠菌。該方法具有PCR 和生物素-親和素雙重放大系統(tǒng)，具有較高的結(jié)合效率。PCR-ELISA 技術(shù)以其快速、靈敏、特異、可批量檢測的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品、病原微生物的檢測中，并取得了很大的成果[12]。

我們采用Lindsley 等[3]改良后的PCR-ELISA 方法，以50 株孢子絲菌菌株為樣本進(jìn)行5 個特異性探針的篩試。實(shí)驗(yàn)過程中筆者發(fā)現(xiàn)，對于探針U26852，在一定濃度范圍內(nèi)，EI 值不隨待篩選探針的濃度增大而增大，而隨PCR 產(chǎn)物濃度的增大而增大。我們擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物濃度為16 ～30 ng/μl，EI 值8.54 ～24.11。其他4 個探針均結(jié)合效率較差且樣本之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而進(jìn)一步測序時發(fā)現(xiàn)5 個探針與標(biāo)準(zhǔn)株核糖體基因序列均具很好的同源性。由此筆者認(rèn)為PCR 產(chǎn)物與探針的DNA 空間構(gòu)象可能影響二者結(jié)合，僅憑顯色強(qiáng)弱來確定探針的結(jié)合效率尚存一定缺陷。基于此，我們著手對5 個探針雜交靶位的32 株孢子絲菌臨床分離株（不同基因型別）核糖體基因序列進(jìn)行測定，以期通過比較探針與靶位同源性的高低來解釋探針敏感性差異的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)32 株菌株的探針雜交靶位核糖體基因序列并無差異，故該現(xiàn)象的產(chǎn)生原因有待進(jìn)一步探討。本方法仍停留在培養(yǎng)基菌落的DNA 提取和擴(kuò)增，未能進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接檢測，故其實(shí)用價(jià)值有待進(jìn)一步提高。

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