許惠方　李玉梅

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法檢測氨酪酸氯化鈉注射液中α-吡咯烷酮含量的方法標準。 方法 選用CAPCELL PAK C18柱為色譜柱；流動相采用pH2.1的磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90：10）；流速維持在1.0mL/min；紫外檢測波長設定為210nm；柱溫為30℃；進樣量為10μL。 結果 α-吡咯烷酮濃度為0.4～5.0mg/L 時其線性關系良好，r=0.9998，平均回收率為100.27%（RSD=0.54%，n=6）。 結論 本研究建立的HPLC法對于氨酪酸氯化鈉注射液中的α-吡咯烷酮測定效果良好且方便快捷。

[關鍵詞] 氨酪酸氯化鈉注射液；α-吡咯烷酮；含量測定；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）22-87-03

氨酪酸（aminobutyric acid）又稱γ-氨酪酸、γ-氨基丁酸，是一類氨基酸類抑制性中樞神經遞質，在體內可促進葡萄糖磷酸酯酶的激活，從而改善腦細胞功能的恢復，對于腦卒中、動脈硬化癥等腦血管疾病及其導致的偏癱、語言障礙，頭部外傷，CO中毒，兒童發(fā)育遲緩等具有一定的治療作用[1-2]。此外，其還可與血氨結合，促進其通過尿液排出，從而降低血氨水平，在肝昏迷的輔助治療中也廣泛應用[3]。目前，臨床中使用的劑型多采用氨酪酸氯化鈉注射液，然而該品種并未被美國及歐洲藥典收載，雖然國家藥品標準收載多個質量標[4-7]，但均未完善。近年來，藥物監(jiān)管力度逐漸加強，對于氨酪酸氯化鈉注射液的質量要求也逐漸提高，國藥典化發(fā)[2010]84號文件的發(fā)布也要求增加氨酪酸氯化鈉注射液中有關物質檢查，以防止藥物不良反應的發(fā)生[8]。目前，對于氨酪酸氯化鈉注射液中α-吡咯烷酮的檢測研究較少，缺少統(tǒng)一的測定標準。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對氨酪酸氯化鈉注射液中α-吡咯烷酮進行檢測，旨在為氨酪酸氯化鈉注射液中α-吡咯烷酮的檢測提供方法標準。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀：主要包括單元泵、柱溫箱、自動進樣器、紫外檢測器、Agilent色譜工作站及相關檢測與分析軟件。

1.2 試劑

氨酪酸氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號：20101009、20101011、20101015；山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：10120903）；α-吡咯烷酮（東北制藥總廠提供）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；實驗用水均為超純水；磷酸二氫鉀、己烷磺酸鈉、磷酸等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱選用CAPCELL PAK C18柱；流動相采用pH 2.1的磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10），磷酸二氫鉀溶液配置流程如下：準確稱取磷酸二氫鉀10.0g及己烷磺酸鈉1.1g，加水稀釋，后利用磷酸調整pH為2.1，定容至1000mL；流速維持在1.0mL/min；紫外檢測波長設定為210nm；柱溫為30℃；進樣量為10μL。

2.2 溶液制備及色譜分析

2.2.1 對照品溶液的制備 取α-吡咯烷酮對照品適量，采用蒸餾水溶解并稀釋至其濃度約為4μg/mL，作為對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精確移取5mL氨酪酸氯化鈉注射液至25mL的量瓶內，蒸餾水稀釋至刻度并混勻，備用。

2.2.3 陰性對照溶液制備 準確稱取NaCl 0.9g，加水溶解，置入100mL容量瓶，定容，以制備0.9%氯化鈉溶液，作為陰性對照溶液使用。

2.2.4 色譜圖 對于上述已制備完成的對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各取10μL進樣，進行液相色譜分離，記錄色譜圖。供試品及對照品溶液中α-吡咯烷酮對應峰的保留時間一致，表明HPLC能夠有效的分離氨酪酸氯化鈉注射液中的α-吡咯烷酮，且陰性對照未出現(xiàn)干擾。

2.3 線性關系試驗

分別取對照品溶液1，5，10，15，20μL進樣，進行液相色譜分析并記錄各自的色譜圖，后以α-吡咯烷酮的濃度為X軸，以對應的色譜峰峰面積為Y軸，繪制散點圖并行線性回歸分析，則有Y=7.052X-0.154，r=0.9998，α-吡咯烷酮濃度為0.4～5.0mg/L時其線性關系良好，可進行α-吡咯烷酮濃度的測定。

2.4 精密度試驗

采用對照品溶液進樣，連續(xù)重復5次，每次進樣10μL，記錄各自的色譜圖，根據各色譜圖α-吡咯烷酮對應峰的峰面積計算RSD為0.69%。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

于0，2，4，6，8，12h分別取供試品溶液10μL進樣，行液相色譜分析，并記錄各色譜圖，測量各不同時間點供試品α-吡咯烷酮對應峰的峰面積，計算峰面積的RSD，結果顯示，RSD為0.28%，表明氨酪酸氯化鈉注射液在12h內較為穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取同批次供試品6份，每份取10mL，置于50mL量瓶中，0.9%氯化鈉溶液定容至刻度，各取10μL進樣進行色譜分離，計算6份溶液中α-吡咯烷酮的含量，結果依次為0.141%、0.140%、0.138%、0.139%、0.140%和0.142%，計算平均含量為0.140%，RSD為1.01%。

2.7 回收率試驗

配制已知α-吡咯烷酮濃度的氨酪酸氯化鈉溶液，連續(xù)取6份，10mL/份，轉入50mL量瓶內，后分別加入40.225μg/mLα-吡咯烷酮溶液5ml，采用0.9%的氯化鈉溶液稀釋至刻度，分別取10μL進樣，進行液相色譜分離，記錄色譜圖，計算會回收率及RSD，如表1所示。結果顯示，平均回收率為100.27%，6份樣品回收率的RSD為0.54%。endprint

2.8 檢出限

檢出限測定溶液的配制如下：取適量對照品溶液，使用蒸餾水稀釋至α-吡咯烷酮濃度為0.4μg/mL。移取1μL檢出限測定溶液進樣，行高效液相色譜，以S/N=3計算檢出限，結果顯示，α-吡咯烷酮的檢出限為0.4ng。

2.9 樣品測定

采用來自不同廠家、不同批次間的氨酪酸氯化鈉注射液作為供試品，制備供試品溶液，分別采用國標法及HPLC法測定樣品中α-吡咯烷酮的含量，結果如表2。安徽雙鶴藥業(yè)有限公司的3批樣品中α-吡咯烷酮含量分別為0.141%、0.143%、0.140%，山東齊都藥業(yè)有限公司的1批樣品中α-吡咯烷酮含量為0.117%。

3 討論

氨酪酸（aminobutyric acid）是一種小分子兩性氨基酸，作為抑制中樞神經的遞質，能夠促進腦細胞功能恢復，對于腦血管疾病及后遺癥、中毒昏迷等的治療具有重要作用。目前臨床所用多為注射液，不僅有效防止藥液暴露，造成微生物、粉塵等的二次污染，同時增加了藥物的安全性及便捷性[9]。

對于氨酪酸的制備工藝，經過文獻檢索和生產要求，主要包括化學水解法和生物酶解法兩類，其中，化學水解法主要是在138～142℃高溫下利用氫氧化鈣水解α-吡咯烷酮所得；生物酶解法主要是通過培養(yǎng)表達4-丁內酰胺水解酶的菌株，利用4-丁內酰胺水解酶對于α-吡咯烷酮的水解作用制的[10-12]。由于兩種方法均以α-吡咯烷酮作為底物，在生產過程中往往難以充分將α-吡咯烷酮徹底轉化，不可避免的在氨酪酸中存在，然而，作為一種高毒性的化學物質，α-吡咯烷酮的殘余，往往會導致不良反應的發(fā)生[13]，因此，加強對于氨酪酸氯化鈉注射液α-吡咯烷酮的含量檢測對于提高藥品質量具有重要作用。

本研究中選用CAPCELL PAK C18柱為色譜柱；流動相采用pH 2.1的磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）；流速維持在1.0mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為30℃；進樣量為10μL，此條件下進行HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，對于α-吡咯烷酮具有較好的分離度，線性關系及回收率均能達到試驗要求。其中，對于流動相的選擇，采用現(xiàn)行氨酪酸氯化鈉注射液質量標準中的流動相進行，未取得理想結果，故采用磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）進行。此外，采用磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）流動相溶液制備α-吡咯烷酮對照品溶液，后采用紫外檢測在200～400nm的波長范圍內掃描，未發(fā)現(xiàn)特征吸收，僅在紫外末端區(qū)有吸收，且陰性對照無干擾出現(xiàn)，因此，選取210nm作為測定波長。

綜上所述，本研究介紹的HPLC法測定氨酪酸氯化鈉注射液中的α-吡咯烷酮具有較好的效果，為改善氨酪酸氯化鈉注射液的質量標準提供了理論依據。

[參考文獻]

[1] 劉艷，徐玉文，李玉梅，等.高效液相色譜法測定氨酪酸氯化鈉注射液中的α-吡咯烷酮[J].中國生化藥物雜志，2012，33（4）：422-424.

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[4] 國家藥典委員會YBH02622006（氨酪酸氯化鈉注射液），國家食品藥品監(jiān)管局藥品標準（試行）[S].2006.

[5] 國家藥典委員會YBH40692005（氨酪酸氯化鈉注射液），國家食品藥品監(jiān)管局藥品標準（試行）[S].2005.

[6]國家藥典委員會YBH33742005（氨酪酸氯化鈉注射液），國家食品藥品監(jiān)管局藥品標準（試行）[S].2005.

[7] 國家藥典委員會YBH24232005（氨酪酸氯化鈉注射液），國家食品藥品監(jiān)管局藥品標準（試行）[S].2005.

[8] 王志遠.氨酪酸氯化鈉注射液的質量研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47（12）：95-96.

[9] 林芳，鄭啟敏，吳勝利.氨酪酸氯化鈉注射液的質量研究[J].科技風，2010（3）：224.

[10] 劉永久，姚作進.HPLC測定氨酪酸氯化鈉注射液中氨酪酸的含量[J].食品與藥品，2013，15（3）：189-190.

[11] 施卉，上官盈盈，翁琳，等.注射用氨酪酸的制備與質量控制[J].醫(yī)藥導報，2006，25（8）：810-812.

[12] 周寒，李健和，黎銀波，等.氨酪酸氯化鈉注射液的研制[J].中南藥學，2007，5（6）：511-515.

[13] 陶功意，李健和，萬小敏，等.注射用氨酪酸的研制[J].中國藥業(yè)，2008，17（12）：23-25.

（收稿日期：2014-08-20）endprint

2.8 檢出限

檢出限測定溶液的配制如下：取適量對照品溶液，使用蒸餾水稀釋至α-吡咯烷酮濃度為0.4μg/mL。移取1μL檢出限測定溶液進樣，行高效液相色譜，以S/N=3計算檢出限，結果顯示，α-吡咯烷酮的檢出限為0.4ng。

2.9 樣品測定

采用來自不同廠家、不同批次間的氨酪酸氯化鈉注射液作為供試品，制備供試品溶液，分別采用國標法及HPLC法測定樣品中α-吡咯烷酮的含量，結果如表2。安徽雙鶴藥業(yè)有限公司的3批樣品中α-吡咯烷酮含量分別為0.141%、0.143%、0.140%，山東齊都藥業(yè)有限公司的1批樣品中α-吡咯烷酮含量為0.117%。

3 討論

氨酪酸（aminobutyric acid）是一種小分子兩性氨基酸，作為抑制中樞神經的遞質，能夠促進腦細胞功能恢復，對于腦血管疾病及后遺癥、中毒昏迷等的治療具有重要作用。目前臨床所用多為注射液，不僅有效防止藥液暴露，造成微生物、粉塵等的二次污染，同時增加了藥物的安全性及便捷性[9]。

對于氨酪酸的制備工藝，經過文獻檢索和生產要求，主要包括化學水解法和生物酶解法兩類，其中，化學水解法主要是在138～142℃高溫下利用氫氧化鈣水解α-吡咯烷酮所得；生物酶解法主要是通過培養(yǎng)表達4-丁內酰胺水解酶的菌株，利用4-丁內酰胺水解酶對于α-吡咯烷酮的水解作用制的[10-12]。由于兩種方法均以α-吡咯烷酮作為底物，在生產過程中往往難以充分將α-吡咯烷酮徹底轉化，不可避免的在氨酪酸中存在，然而，作為一種高毒性的化學物質，α-吡咯烷酮的殘余，往往會導致不良反應的發(fā)生[13]，因此，加強對于氨酪酸氯化鈉注射液α-吡咯烷酮的含量檢測對于提高藥品質量具有重要作用。

本研究中選用CAPCELL PAK C18柱為色譜柱；流動相采用pH 2.1的磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）；流速維持在1.0mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為30℃；進樣量為10μL，此條件下進行HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，對于α-吡咯烷酮具有較好的分離度，線性關系及回收率均能達到試驗要求。其中，對于流動相的選擇，采用現(xiàn)行氨酪酸氯化鈉注射液質量標準中的流動相進行，未取得理想結果，故采用磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）進行。此外，采用磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）流動相溶液制備α-吡咯烷酮對照品溶液，后采用紫外檢測在200～400nm的波長范圍內掃描，未發(fā)現(xiàn)特征吸收，僅在紫外末端區(qū)有吸收，且陰性對照無干擾出現(xiàn)，因此，選取210nm作為測定波長。

綜上所述，本研究介紹的HPLC法測定氨酪酸氯化鈉注射液中的α-吡咯烷酮具有較好的效果，為改善氨酪酸氯化鈉注射液的質量標準提供了理論依據。

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[13] 陶功意，李健和，萬小敏，等.注射用氨酪酸的研制[J].中國藥業(yè)，2008，17（12）：23-25.

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2.8 檢出限

檢出限測定溶液的配制如下：取適量對照品溶液，使用蒸餾水稀釋至α-吡咯烷酮濃度為0.4μg/mL。移取1μL檢出限測定溶液進樣，行高效液相色譜，以S/N=3計算檢出限，結果顯示，α-吡咯烷酮的檢出限為0.4ng。

2.9 樣品測定

采用來自不同廠家、不同批次間的氨酪酸氯化鈉注射液作為供試品，制備供試品溶液，分別采用國標法及HPLC法測定樣品中α-吡咯烷酮的含量，結果如表2。安徽雙鶴藥業(yè)有限公司的3批樣品中α-吡咯烷酮含量分別為0.141%、0.143%、0.140%，山東齊都藥業(yè)有限公司的1批樣品中α-吡咯烷酮含量為0.117%。

3 討論

氨酪酸（aminobutyric acid）是一種小分子兩性氨基酸，作為抑制中樞神經的遞質，能夠促進腦細胞功能恢復，對于腦血管疾病及后遺癥、中毒昏迷等的治療具有重要作用。目前臨床所用多為注射液，不僅有效防止藥液暴露，造成微生物、粉塵等的二次污染，同時增加了藥物的安全性及便捷性[9]。

對于氨酪酸的制備工藝，經過文獻檢索和生產要求，主要包括化學水解法和生物酶解法兩類，其中，化學水解法主要是在138～142℃高溫下利用氫氧化鈣水解α-吡咯烷酮所得；生物酶解法主要是通過培養(yǎng)表達4-丁內酰胺水解酶的菌株，利用4-丁內酰胺水解酶對于α-吡咯烷酮的水解作用制的[10-12]。由于兩種方法均以α-吡咯烷酮作為底物，在生產過程中往往難以充分將α-吡咯烷酮徹底轉化，不可避免的在氨酪酸中存在，然而，作為一種高毒性的化學物質，α-吡咯烷酮的殘余，往往會導致不良反應的發(fā)生[13]，因此，加強對于氨酪酸氯化鈉注射液α-吡咯烷酮的含量檢測對于提高藥品質量具有重要作用。

本研究中選用CAPCELL PAK C18柱為色譜柱；流動相采用pH 2.1的磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）；流速維持在1.0mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為30℃；進樣量為10μL，此條件下進行HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，對于α-吡咯烷酮具有較好的分離度，線性關系及回收率均能達到試驗要求。其中，對于流動相的選擇，采用現(xiàn)行氨酪酸氯化鈉注射液質量標準中的流動相進行，未取得理想結果，故采用磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）進行。此外，采用磷酸二氫鉀溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）流動相溶液制備α-吡咯烷酮對照品溶液，后采用紫外檢測在200～400nm的波長范圍內掃描，未發(fā)現(xiàn)特征吸收，僅在紫外末端區(qū)有吸收，且陰性對照無干擾出現(xiàn)，因此，選取210nm作為測定波長。

綜上所述，本研究介紹的HPLC法測定氨酪酸氯化鈉注射液中的α-吡咯烷酮具有較好的效果，為改善氨酪酸氯化鈉注射液的質量標準提供了理論依據。

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