王吉成等

[摘要] 目的 探討桑葉固體發(fā)酵前后70%乙醇提取物的體外抗氧化活性。 方法 應(yīng)用“藥用真菌固體發(fā)酵工程”的原理和方法，以桑葉為藥性基質(zhì)，冠突散囊菌為發(fā)酵菌種，在一定條件下進行固體發(fā)酵，對發(fā)酵物用70%乙醇進行提取。并以維生素C（Vc）和乙二胺四乙酸（EDTA）為陽性對照，以清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、·OH自由基、鐵還原能力及與Fe2+螯合能力5個指標(biāo)對發(fā)酵前后桑葉體外抗氧化活性進行評價；同時對發(fā)酵前后總黃酮、總酚酸含量進行測定。 結(jié)果 未發(fā)酵桑葉70%乙醇提取物清除自由基能力及鐵還原能力優(yōu)于固體發(fā)酵7 d后桑葉的70%乙醇提取物，但對于Fe2+螯合能力而言，發(fā)酵后的桑葉70%乙醇提取物較未發(fā)酵前有所升高。其中未發(fā)酵桑葉70%乙醇提取物DPPH、ABTS、Fe2+螯合能力的IC50值分別為：4.69、2.03、20.89 mg/mL，而固體發(fā)酵7 d后的桑葉70%乙醇提取物三者的IC50值分別為：17.63、1.87、9.20 mg/mL；同時含量測定結(jié)果顯示，發(fā)酵后桑葉中總多酚含量較發(fā)酵前明顯下降，而發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量卻高于發(fā)酵前總黃酮含量。其中發(fā)酵前桑葉中總黃酮、總酚酸含量分別為4.39、3.95 mg/mL，而發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量上升至5.37 mg/g，總酚酸下降為1.55 mg/g。 結(jié)論 固體發(fā)酵7 d，能夠降低桑葉清除自由基的能力及鐵還原能力，但卻能升高其螯合能力。

[關(guān)鍵詞] 固體發(fā)酵；冠突散囊菌；桑葉；體外抗氧化活性；總黃酮；總多酚

[中圖分類號] R96 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（c）-0033-06

Study on antioxidant activities of the solid fermentation and non-fermentation products in mulberry leaves

WANG Jicheng1，2 LIU Xuan1 XU Zhiwei2 CHE Guanda1 CHENG Xuan1 TANG Jintian1 ZHAI Yanjun2

1.Education Ministry Key Laboratory of Technology and Radiation Imaging， Department of Engineering Physics of Tsinghua University， Beijing 100084， China； 2.College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Dalian 116600， China

[Abstract] Objective To investigate the in vitro antioxidant activities between solid fermentation and non-fermentation products in mulberry leaves. Methods Guided by the theory of medicinal fungi solid fermentation engineering， with mulberry leaves used as medicinal matrix and the activated eurotiumcristatumas inoculated fungi， the activity of its total extract （70% ethanol） was evaluated by several in vitro experiments including DPPH assay， ABTS assay， ·OH radicals assay， ferric-reducing power（FRAP） assay and ion-chelating assay using ascorbic acid and EDTA as positive controls. At the same time， the contents total flavonoids and total phenolic in fermentation and non-fermentation were determinated. Results The 70% ethanol extract of non-fermented mulberry leaves had stronger free radical scavenging capacity and FRAP than that of the fermented one. In a while， the 70% ethanol extract of fermented mulberry leaves was found stronger ion-chelating ability. For example， the total extract of the non-fermented one had capacity of scavenging DPPH， ABTS and ion-chelating ability with IC50 values of 4.69， 2.03 and 20.89 mg/mL， respectively. On the contrary， the total extract of the fermentation of mulberry leaves showed capacity of scavenging DPPH， ABTS and ion-chelating ability with IC50 values of 17.63， 1.87 and 9.20 mg/mL， respectively. At the same time， the result of contents determination displayed that the total phenolic contents of the fermented one was significantly lower than that of the non-fermented one， while the total flavonoids of the fermented content was increased than that of the non-fermented one. For example， the total flavonoids and phenolic content of the non-fermentation products were 4.39 and 3.95 mg/g， but that of fermentation were 5.37 and 1.55 mg/g. Conclusion The capacities of free radical scavenging and FRAP decline after 7 days fermentation， while the ion-chelating ability increases.

[Key words] Solid fermentation； Eurotiumcristatum； Mul-berry leaf； In vitro antioxidant activities； Total flavonoids； Total phenolic

桑葉為?？浦参颩orus alba L.的干燥葉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，稱為“神仙草”，具有疏散風(fēng)熱，滋陰補血，降壓利尿，益肝通氣之功效[1]。桑葉中含有很多活性物質(zhì)，如多酚類、黃酮及其苷類、生物堿類、多糖類、揮發(fā)油、各種氨基酸、微量元素等[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，桑葉具有抗氧化、抗衰老、降血脂和降糖等活性。其中黃酮類、多酚類是其功效的主要活性成分之一。

冠突散囊菌是茯磚茶在“發(fā)花”過程中自然形成的一種具有益生性能的優(yōu)勢菌[3-5]，由于它的存在，使得茯磚茶的色、香、味得以不同于其他茶類，并且具有抗氧化[6]、促消化、降脂減肥[7]、抑菌[8]、抗癌[9]等保健功效。同時冠突散囊菌還可以在非黑茶茶類和幾種常見的藥用植物上“發(fā)花”，如紅茶、綠茶、銀杏葉、枇杷葉、杭菊花[10-11]。

目前，尚無將冠突散囊菌接種到桑葉上進行固體發(fā)酵的研究，本研究創(chuàng)新性地以中藥桑葉為例，結(jié)合微生物發(fā)酵方式，對該藥固體發(fā)酵前后70%乙醇提取物的抗氧化活性進行比較，同時對發(fā)酵前后桑葉中總黃酮、總酚酸含量進行測定，以探討固體發(fā)酵技術(shù)對中藥成分提取及藥理活性的影響。

1 儀器與試藥

1.1 原料與試劑

桑葉產(chǎn)自安徽（生產(chǎn)批號：20130701），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉；冠突散囊菌由清華大學(xué)工程物理系粒子技術(shù)與輻射成像教育部重點實驗室分離獲得并鑒定[12]；馬鈴薯葡萄糖瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蘆丁購自成都曼斯特生物科技公司（純度≥98%）；沒食子酸購自成中國食品藥品檢定研究院（純度≥98%）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸二銨鹽）（ABTS）購自Amresco公司；1，1-二苯基-2-三硝苯肼（DPPH）購自Alfa Aesar公司；菲洛嗪購自AALDRICH公司；水楊酸購自西隴化工股份有限公司；維生素C（Vc）購自廣州化學(xué)試劑廠；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VARIOSKAN FLASH型全波長掃描多功能讀數(shù)儀為美國Thermo Scientific公司的產(chǎn)品；KQ 5200 DE型超聲儀為昆山市超聲儀器有限公司的產(chǎn)品；EYEL4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為日本EYELA公司的產(chǎn)品；Venticell烘箱為德國MMM公司的產(chǎn)品；DZE-6050型真空干燥箱為北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司的產(chǎn)品；SVE-4A1型垂直流超凈工作臺為新加坡ESCO公司的產(chǎn)品；AL204-IC型電子天平為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司的產(chǎn)品；SHZ-CB型循環(huán)水式真空泵為鞏義市英峪予華儀器廠的產(chǎn)品；微量移液器為美國Thermo公司的產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為德國MMM公司的產(chǎn)品；NANOpure超純水系統(tǒng)為美國Barnstead公司的產(chǎn)品；3-18K型超速離心機為美國Sigma公司的產(chǎn)品。

2 方法

2.1 樣品液的制備

2.1.1 未發(fā)酵桑葉提取液的制備

稱取8 g桑葉于500 mL錐形瓶，加70%乙醇500 mL超聲提取2次，每次45 min。立即減壓過濾，殘渣用少量70%乙醇洗3次，合并濾液，濃縮得干膏。精密稱取各樣品0.5 g（生藥量），用2 mL 70%乙醇溶解，超聲提取2次，最后用適量70%乙醇定容至5 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL樣品溶液。用70%乙醇依次稀釋，得到質(zhì)量濃度為：20、12.5、5、4、2、0.8、0.16、0.032 mg/mL的供試品溶液。

2.1.2 固體發(fā)酵桑葉提取液的制備

2.1.2.1 固體發(fā)酵桑葉 照本實驗室前期研究茯磚茶中冠突散囊菌的分離純化方法[12]，將得到純化后的冠突散囊菌在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d。在無菌操作條件下，吸入無菌水5 mL，用接種環(huán)將黃色閉囊殼刮下，懸浮于無菌水中，再將懸浮液吸入盛有95 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，30℃，150 r/min振搖20 min，制成均勻的孢子懸液。測定孢子數(shù)量，孢子濃度為5.0×108～6.0×108 cfu/mL。稱取8 g桑葉于500 mL錐形瓶中，高壓濕熱滅菌后，待瓶溫恢復(fù)到室溫。在超凈工作臺中進行接種操作。將制備好的50 mL菌懸液均勻噴灑到8 g桑葉上，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

2.1.2.2固體發(fā)酵后桑葉提取液的制備 將發(fā)酵后的桑葉參照“2.1.1”項下方法進行提取，依法得到相同質(zhì)量濃度的供試品溶液。

2.2 體外抗氧化活性測定

2.2.1 對自由基清除能力的測定

2.2.1.1 DPPH自由基清除試驗 采用Tagashira and Ohtake（1998）的方法，略作修改。分別吸取各供試品溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL 0.2 mmol/L DPPH自由基測定液，迅速混勻，37℃恒溫反應(yīng)30 min，在510 nm處測定吸光度。樣品空白對照以無水乙醇代替DPPH自由基測定液，其余步驟與樣品相同；陰性對照以70%乙醇代替樣品溶液，Vc作為陽性對照，其余步驟與樣品相同。所有的測量值均做3個復(fù)孔取其平均值。樣品的抗氧化程度用對DPPH自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越強，反之則弱。計算公式為：清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%，其中，A0為陰性對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品空白對照組吸光度。

2.2.1.2 ABTS+自由基清除試驗 參考文獻[13]及[14]的方法，略作修改。吸取各供試品溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL ABTS+自由基測定液[7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，在734 nm處調(diào)節(jié)吸光度為（0.700±0.020）]，混勻，室溫下反應(yīng)30 min，在734 nm處測定吸光度。樣品空白對照以50%乙醇代替ABTS+自由基測定液，其余步驟與樣品相同；陰性對照以70%乙醇代替樣品溶液，Vc作為陽性對照。其余步驟與樣品相同。所有的測量值均做3個復(fù)孔取其平均值。樣品的抗氧化程度用對ABTS+自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越強，反之則弱。樣品對ABTS+自由基的清除率計算公式為：清除率=[1-（A1-A2）/A0]，其中A0為陰性對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品空白對照組吸光度。

2.2.1.3 ·OH自由基清除試驗 參考文獻[15]的方法，略作修改。向5 mL比色管中依次移取1.5 mL硫酸亞鐵溶液

2.3桑葉中總黃酮、總酚酸含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備

2.3.1.1 未發(fā)酵桑葉供試品溶液的制備 精密稱取參照“2.1.1”項下干膏0.2 g（生藥量），用3 mL、70%乙醇超聲提取20 min，重復(fù)操作2次，最后用70%乙醇定容到10 mL。制得0.02 g/mL（生藥濃度）的未發(fā)酵桑葉供試品溶液。

2.3.1.2 固體發(fā)酵7 d桑葉供試品溶液的制備 精密稱定將“2.1.2.2”項下的干膏0.2 g（生藥量），參照“2.3.1.1”項下方法，得0.02 g/mL固體發(fā)酵7 d桑葉供試品溶液。

2.3.2 發(fā)酵前后桑葉中總黃酮含量測定

2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸取質(zhì)量濃度為0.4、0.2、0.1、0.04、0.02、0.01、0.005 mg/mL的蘆丁對照品溶液1 mL，加2 mL 0.1 mol/L AlCl3和1 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH =5.2），搖勻，40℃水浴10 min，吸取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，在405 nm處測定吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=3.9748X-0.0032，r=0.9998。

2.3.2.2 樣品總黃酮含量測定 將發(fā)酵前后樣品溶液參照“2.3.2.1”項下方法顯色，測定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算樣品中總黃酮含量，結(jié)果表示為蘆丁當(dāng)量（mg/g）。

2.3.3 總多酚含量測定

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 吸取20 μL質(zhì)量濃度為0.01～0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于96孔板中，加入100 μL 10%福林酚水溶液，混勻，反應(yīng)5 min，加入80 μL 7.5%碳酸鈉溶液，混勻，室溫下反應(yīng)60 min，在765 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=5.8477X+0.0152，r=0.9994。

2.3.3.2 樣品總多酚含量測定 將發(fā)酵前后樣品溶液參照“2.3.3.1”項下方法顯色，測定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算樣品中總多酚含量，結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量（mg/g）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 固體發(fā)酵前后桑葉中總黃酮、總酚酸含量變化

固體發(fā)酵前后桑葉中總黃酮、總酚酸含量結(jié)果見圖1。固體發(fā)酵7 d后的桑葉中總黃酮含量從未發(fā)酵時的4.39 mg/g增加到5.37 mg/g，上升了22%；而桑葉中總多酚含量從未發(fā)酵時的3.95 mg/g減少到1.55 mg/g，下降了近61%。表明采用冠突散囊菌對桑葉進行固體發(fā)酵，可以明顯改變桑葉中總黃酮、總酚酸的含量。

圖1 固體發(fā)酵前后桑葉中總黃酮、總酚酸含量變化

3.2清除DPPH自由基能力

清除DPPH自由基能力見表1?？梢姲l(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對DPPH自由基均有一定的清除作用，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。且各濃度梯度下，固體發(fā)酵7 d的桑葉70%乙醇提取物清除DPPH自由基能力較發(fā)酵前均有所下降，其中陽性對照Vc、未發(fā)酵桑葉70%乙醇提取物清除DPPH自由基IC50值分別為：0.028、4.69 mg/mL，而發(fā)酵后桑葉70%乙醇提取物的IC50值為17.63 mg/mL。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力IC50差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005）。

3.3 清除ABTS自由基能力

清除ABTS自由基能力見表2。可見發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對ABTS自由基均有一定的清除作用，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。且各濃度梯度下，固體發(fā)酵7 d的桑葉70%乙醇提取物清除ABTS自由基能力較發(fā)酵前均有所上升，其中陽性對照Vc以及發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物清除ABTS自由基IC50值分別為：0.03、2.03、1.87 mg/mL，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力IC50差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.169）。

3.4 ·OH自由基清除能力

清除·OH自由基能力的測定結(jié)果顯示，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對·OH自由基的清除能力均比較低，在實驗濃度為20 mg/mL時，清除能力才達(dá)到23.78%、25.74%。故發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物對·OH自由基具有很低的清除能力。

3.5 鐵離子的還原/抗氧化能力

樣品與Fe3+還原能力見表3。隨著樣品濃度的升高，其吸光度也逐漸增大。比較發(fā)酵前后70%乙醇提取物對Fe3+還原能力發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前吸光度較發(fā)酵后吸光度要高。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵前后樣品濃度高于0.08 mg/mL時，各樣品相同濃度間吸光度差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。說明發(fā)酵降低了桑葉70%乙醇提取物對Fe3+的還原能力。

表3 固體發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取物的Fe3+還原能力

3.6 螯合能力

樣品與Fe2+螯合能力見表4。由結(jié)果可知樣品的螯合能力與濃度呈明顯的劑量關(guān)系。其中發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取部位的半數(shù)螯合率分別為：20.89、9.20 mg/mL，而EDTA半數(shù)螯合率為0.14 mg/mL。統(tǒng)計結(jié)果顯示，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取部位與Fe2+螯合能力差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。由半數(shù)螯合率可知，固體發(fā)酵7 d桑葉70%乙醇提取部位螯合能力大于發(fā)酵前桑葉70%乙醇螯合能力，但二者均小于陽性對照EDTA與Fe2+螯合能力。

4 討論

近年來，活性氧和自由基學(xué)說已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點，因此評價與篩選具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物成為了科學(xué)研究的新趨勢。目前尚無關(guān)于將冠突散囊菌采用固體發(fā)酵方式接種到桑葉上的報道。本研究通過在桑葉上固體接種冠突散囊菌，并對其發(fā)酵一周后產(chǎn)物的抗氧化活性成分含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用冠突散囊菌的發(fā)酵，可增加桑葉中總黃酮含量的同時，降低了桑葉總總酚酸的含量。

利用冠突散囊菌固體發(fā)酵一周，可增加桑葉中總黃酮含量。這一結(jié)果跟傳統(tǒng)理論“固體發(fā)酵茯磚茶導(dǎo)致其總黃酮含量下降”相反。但微生物及其代謝過程中產(chǎn)生豐富的酶類，能降解大量中藥植物纖維素，降低淀粉等高分子對中藥成分的包裹作用，有利于有效成分的溶出[17-19]是導(dǎo)致發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量有所上升的原因之一。同時有報道稱發(fā)酵桑葉茶時，桑葉中總黃酮含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢[20]，因此以天數(shù)為變量，活性物質(zhì)含量為指標(biāo)的實驗，有待進一步完善。

本研究采用DPPH、ABTS+、Fe離子的還原/抗氧化能力、·OH和Fe2+螯合能力5種抗氧化方法，對桑葉及其固體發(fā)酵品70%乙醇提取部位的抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取部位的抗氧化活性較弱，均低于陽性對照Vc及EDTA。與生品相比，經(jīng)固體發(fā)酵后的桑葉70%乙醇提取部位的抗氧化能力發(fā)生了變化。其中對于清除自由基和鐵還原能力而言，未發(fā)酵效果優(yōu)于發(fā)酵后桑葉70%乙醇提取物；但固體發(fā)酵卻提升了Fe2+螯合能力。目前，發(fā)酵產(chǎn)物中的抗氧化活性成分還尚不明確，由實驗結(jié)果可以初步推測，起到清除自由基作用的主要活性成分可能是非黃酮的多酚類物質(zhì)，而與Fe2+螯合能力的主要活性成分有可能為黃酮類成分。

[參考文獻]

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版，1979.

[2] 孫蓮，楊文菊，劉龍.桑葉揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2009，34（7）：879-883.

[3] 溫瓊英，劉素純.茯磚茶發(fā)花中優(yōu)勢菌的演變規(guī)律[J].茶葉科學(xué)，1911，11（Z）：56-62.

[4] Xu A，Wang Y，Wen J，et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fu zhuan brick tea[J].Int J Food Microbiol，2011，146（1）：14-22.

[5] 陳云蘭.茯磚茶“冠突散囊菌”的分離鑒定及其對茯磚茶品質(zhì)的影響[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[6] 歐陽梅，熊昌云，屠幼英，等.冠突散囊菌對茶葉品質(zhì)成分及其抗氧化活性影響[J].菌物學(xué)報，2011，30（2）：343-348.

[7] 袁勇，黃建安，徐小江，等.茯茶中“金花”孢子粉提取物對體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯代謝的影響[J].茶葉科學(xué)，2011，31（2）：129-135.

[8] 李佳蓮，胡博涵，趙勇彪，等.冠突散囊菌發(fā)酵液的抑菌作用[J].食品科學(xué)，2011，32（11）：157-161.

[9] 郭敏，張寶善，金曉輝.微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖的研究進展[J].微生物學(xué)通報，2008，35（7）：1084-1090.

[10] 陳桂梅.冠突散囊菌研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，40（2）：179-182.

[11] 蔡正安，劉素純，劉杏益，等.冠突散囊菌在不同茶類及幾種植物材料上“發(fā)花”的研究[J].茶葉科學(xué)，2010，30（4）：263-268.

[12] 郝鵬飛.辣椒葉“金花”菌發(fā)酵產(chǎn)物及活性研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[13] Tagashira M，Ohtate Y. A new antioxidative1，3-benzodioxole from Melissa officials [J]. Planta Med，1998，64：555.

[14] Pellegrini N，Ke R，Yang M，et al. Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2，2′-azinobis（3-ethylene benzothiazoline-6-sulfonic acid） radical captions decolonization assay [J]. Methods in Enzymology，1999，299：379-389.

[15] 馬燕妮，張清華，劉玉紅，等.桑葉黃酮與鬼針草黃酮組分配伍抗氧化協(xié)同作用研究[J].食品與藥品，2013，15（3）：160-161.

[16] 潘喬丹，熊圓圓，陳文東，等.扁擔(dān)藤不同極性成分抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學(xué)，2013，19（1）：232-235.

[17] Vane CH，Drange TC，Snape CE. Biodegradation of oak（Queues alba） wood during growth of the shiitake mushroom（Lenticulars eddoes）：a molecular approach [J]. J Agaric Food Chem，2003，51（4）：947-957.

[18] Yang X，Chen H，Gao H，et al. Bioconversion of com straw by coupling ensiling and solid-state fermentation[J]. Bioresour Technol，2001，78（3）：277-286.

[19] Sati SC，Bishi S. Utilization of various carbon sources for the growth of waterborne conidial fungi[J]. Mycologia， 2006，98（5）：678-289.

[20] 肖洪，黃先智，沈以紅，等.不同發(fā)酵條件對桑葉茶生物活性成分含量的影響[J].食品科學(xué)，2013，34（23）：216-220.

（收稿日期：2014-08-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）

4 討論

近年來，活性氧和自由基學(xué)說已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點，因此評價與篩選具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物成為了科學(xué)研究的新趨勢。目前尚無關(guān)于將冠突散囊菌采用固體發(fā)酵方式接種到桑葉上的報道。本研究通過在桑葉上固體接種冠突散囊菌，并對其發(fā)酵一周后產(chǎn)物的抗氧化活性成分含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用冠突散囊菌的發(fā)酵，可增加桑葉中總黃酮含量的同時，降低了桑葉總總酚酸的含量。

利用冠突散囊菌固體發(fā)酵一周，可增加桑葉中總黃酮含量。這一結(jié)果跟傳統(tǒng)理論“固體發(fā)酵茯磚茶導(dǎo)致其總黃酮含量下降”相反。但微生物及其代謝過程中產(chǎn)生豐富的酶類，能降解大量中藥植物纖維素，降低淀粉等高分子對中藥成分的包裹作用，有利于有效成分的溶出[17-19]是導(dǎo)致發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量有所上升的原因之一。同時有報道稱發(fā)酵桑葉茶時，桑葉中總黃酮含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢[20]，因此以天數(shù)為變量，活性物質(zhì)含量為指標(biāo)的實驗，有待進一步完善。

本研究采用DPPH、ABTS+、Fe離子的還原/抗氧化能力、·OH和Fe2+螯合能力5種抗氧化方法，對桑葉及其固體發(fā)酵品70%乙醇提取部位的抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取部位的抗氧化活性較弱，均低于陽性對照Vc及EDTA。與生品相比，經(jīng)固體發(fā)酵后的桑葉70%乙醇提取部位的抗氧化能力發(fā)生了變化。其中對于清除自由基和鐵還原能力而言，未發(fā)酵效果優(yōu)于發(fā)酵后桑葉70%乙醇提取物；但固體發(fā)酵卻提升了Fe2+螯合能力。目前，發(fā)酵產(chǎn)物中的抗氧化活性成分還尚不明確，由實驗結(jié)果可以初步推測，起到清除自由基作用的主要活性成分可能是非黃酮的多酚類物質(zhì)，而與Fe2+螯合能力的主要活性成分有可能為黃酮類成分。

[參考文獻]

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版，1979.

[2] 孫蓮，楊文菊，劉龍.桑葉揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2009，34（7）：879-883.

[3] 溫瓊英，劉素純.茯磚茶發(fā)花中優(yōu)勢菌的演變規(guī)律[J].茶葉科學(xué)，1911，11（Z）：56-62.

[4] Xu A，Wang Y，Wen J，et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fu zhuan brick tea[J].Int J Food Microbiol，2011，146（1）：14-22.

[5] 陳云蘭.茯磚茶“冠突散囊菌”的分離鑒定及其對茯磚茶品質(zhì)的影響[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[6] 歐陽梅，熊昌云，屠幼英，等.冠突散囊菌對茶葉品質(zhì)成分及其抗氧化活性影響[J].菌物學(xué)報，2011，30（2）：343-348.

[7] 袁勇，黃建安，徐小江，等.茯茶中“金花”孢子粉提取物對體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯代謝的影響[J].茶葉科學(xué)，2011，31（2）：129-135.

[8] 李佳蓮，胡博涵，趙勇彪，等.冠突散囊菌發(fā)酵液的抑菌作用[J].食品科學(xué)，2011，32（11）：157-161.

[9] 郭敏，張寶善，金曉輝.微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖的研究進展[J].微生物學(xué)通報，2008，35（7）：1084-1090.

[10] 陳桂梅.冠突散囊菌研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，40（2）：179-182.

[11] 蔡正安，劉素純，劉杏益，等.冠突散囊菌在不同茶類及幾種植物材料上“發(fā)花”的研究[J].茶葉科學(xué)，2010，30（4）：263-268.

[12] 郝鵬飛.辣椒葉“金花”菌發(fā)酵產(chǎn)物及活性研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[13] Tagashira M，Ohtate Y. A new antioxidative1，3-benzodioxole from Melissa officials [J]. Planta Med，1998，64：555.

[14] Pellegrini N，Ke R，Yang M，et al. Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2，2′-azinobis（3-ethylene benzothiazoline-6-sulfonic acid） radical captions decolonization assay [J]. Methods in Enzymology，1999，299：379-389.

[15] 馬燕妮，張清華，劉玉紅，等.桑葉黃酮與鬼針草黃酮組分配伍抗氧化協(xié)同作用研究[J].食品與藥品，2013，15（3）：160-161.

[16] 潘喬丹，熊圓圓，陳文東，等.扁擔(dān)藤不同極性成分抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學(xué)，2013，19（1）：232-235.

[17] Vane CH，Drange TC，Snape CE. Biodegradation of oak（Queues alba） wood during growth of the shiitake mushroom（Lenticulars eddoes）：a molecular approach [J]. J Agaric Food Chem，2003，51（4）：947-957.

[18] Yang X，Chen H，Gao H，et al. Bioconversion of com straw by coupling ensiling and solid-state fermentation[J]. Bioresour Technol，2001，78（3）：277-286.

[19] Sati SC，Bishi S. Utilization of various carbon sources for the growth of waterborne conidial fungi[J]. Mycologia， 2006，98（5）：678-289.

[20] 肖洪，黃先智，沈以紅，等.不同發(fā)酵條件對桑葉茶生物活性成分含量的影響[J].食品科學(xué)，2013，34（23）：216-220.

（收稿日期：2014-08-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）

4 討論

近年來，活性氧和自由基學(xué)說已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點，因此評價與篩選具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物成為了科學(xué)研究的新趨勢。目前尚無關(guān)于將冠突散囊菌采用固體發(fā)酵方式接種到桑葉上的報道。本研究通過在桑葉上固體接種冠突散囊菌，并對其發(fā)酵一周后產(chǎn)物的抗氧化活性成分含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用冠突散囊菌的發(fā)酵，可增加桑葉中總黃酮含量的同時，降低了桑葉總總酚酸的含量。

利用冠突散囊菌固體發(fā)酵一周，可增加桑葉中總黃酮含量。這一結(jié)果跟傳統(tǒng)理論“固體發(fā)酵茯磚茶導(dǎo)致其總黃酮含量下降”相反。但微生物及其代謝過程中產(chǎn)生豐富的酶類，能降解大量中藥植物纖維素，降低淀粉等高分子對中藥成分的包裹作用，有利于有效成分的溶出[17-19]是導(dǎo)致發(fā)酵后桑葉中總黃酮含量有所上升的原因之一。同時有報道稱發(fā)酵桑葉茶時，桑葉中總黃酮含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢[20]，因此以天數(shù)為變量，活性物質(zhì)含量為指標(biāo)的實驗，有待進一步完善。

本研究采用DPPH、ABTS+、Fe離子的還原/抗氧化能力、·OH和Fe2+螯合能力5種抗氧化方法，對桑葉及其固體發(fā)酵品70%乙醇提取部位的抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明，發(fā)酵前后桑葉70%乙醇提取部位的抗氧化活性較弱，均低于陽性對照Vc及EDTA。與生品相比，經(jīng)固體發(fā)酵后的桑葉70%乙醇提取部位的抗氧化能力發(fā)生了變化。其中對于清除自由基和鐵還原能力而言，未發(fā)酵效果優(yōu)于發(fā)酵后桑葉70%乙醇提取物；但固體發(fā)酵卻提升了Fe2+螯合能力。目前，發(fā)酵產(chǎn)物中的抗氧化活性成分還尚不明確，由實驗結(jié)果可以初步推測，起到清除自由基作用的主要活性成分可能是非黃酮的多酚類物質(zhì)，而與Fe2+螯合能力的主要活性成分有可能為黃酮類成分。

[參考文獻]

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版，1979.

[2] 孫蓮，楊文菊，劉龍.桑葉揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2009，34（7）：879-883.

[3] 溫瓊英，劉素純.茯磚茶發(fā)花中優(yōu)勢菌的演變規(guī)律[J].茶葉科學(xué)，1911，11（Z）：56-62.

[4] Xu A，Wang Y，Wen J，et al. Fungal community associated with fermentation and storage of Fu zhuan brick tea[J].Int J Food Microbiol，2011，146（1）：14-22.

[5] 陳云蘭.茯磚茶“冠突散囊菌”的分離鑒定及其對茯磚茶品質(zhì)的影響[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[6] 歐陽梅，熊昌云，屠幼英，等.冠突散囊菌對茶葉品質(zhì)成分及其抗氧化活性影響[J].菌物學(xué)報，2011，30（2）：343-348.

[7] 袁勇，黃建安，徐小江，等.茯茶中“金花”孢子粉提取物對體外誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯代謝的影響[J].茶葉科學(xué)，2011，31（2）：129-135.

[8] 李佳蓮，胡博涵，趙勇彪，等.冠突散囊菌發(fā)酵液的抑菌作用[J].食品科學(xué)，2011，32（11）：157-161.

[9] 郭敏，張寶善，金曉輝.微生物發(fā)酵生產(chǎn)多糖的研究進展[J].微生物學(xué)通報，2008，35（7）：1084-1090.

[10] 陳桂梅.冠突散囊菌研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，40（2）：179-182.

[11] 蔡正安，劉素純，劉杏益，等.冠突散囊菌在不同茶類及幾種植物材料上“發(fā)花”的研究[J].茶葉科學(xué)，2010，30（4）：263-268.

[12] 郝鵬飛.辣椒葉“金花”菌發(fā)酵產(chǎn)物及活性研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[13] Tagashira M，Ohtate Y. A new antioxidative1，3-benzodioxole from Melissa officials [J]. Planta Med，1998，64：555.

[14] Pellegrini N，Ke R，Yang M，et al. Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2，2′-azinobis（3-ethylene benzothiazoline-6-sulfonic acid） radical captions decolonization assay [J]. Methods in Enzymology，1999，299：379-389.

[15] 馬燕妮，張清華，劉玉紅，等.桑葉黃酮與鬼針草黃酮組分配伍抗氧化協(xié)同作用研究[J].食品與藥品，2013，15（3）：160-161.

[16] 潘喬丹，熊圓圓，陳文東，等.扁擔(dān)藤不同極性成分抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學(xué)，2013，19（1）：232-235.

[17] Vane CH，Drange TC，Snape CE. Biodegradation of oak（Queues alba） wood during growth of the shiitake mushroom（Lenticulars eddoes）：a molecular approach [J]. J Agaric Food Chem，2003，51（4）：947-957.

[18] Yang X，Chen H，Gao H，et al. Bioconversion of com straw by coupling ensiling and solid-state fermentation[J]. Bioresour Technol，2001，78（3）：277-286.

[19] Sati SC，Bishi S. Utilization of various carbon sources for the growth of waterborne conidial fungi[J]. Mycologia， 2006，98（5）：678-289.

[20] 肖洪，黃先智，沈以紅，等.不同發(fā)酵條件對桑葉茶生物活性成分含量的影響[J].食品科學(xué)，2013，34（23）：216-220.

（收稿日期：2014-08-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）