劉彩霞++康世榮

[摘要] 目的 研究并分析胃癌組織中PIM-3的異常表達(dá)及其臨床意義。 方法 選擇2013年6月～2014年2月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行胃癌組織根治性切除的患者50例為研究對象，采用免疫組織化學(xué)法（SP法）分別測定PIM-3在50例胃癌組織和及其中25例患者的癌旁組織中的表達(dá)，分析PIM-3與性別、年齡、腫瘤大小等有關(guān)參數(shù)的相關(guān)性。 結(jié)果 癌旁組織中PIM-3的表達(dá)陽性率（16%）顯著低于胃癌組織（90%）；PIM-3的表達(dá)與胃癌組織中分化程度、浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移和靜脈轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P < 0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑關(guān)系不大（P > 0.05）。 結(jié)論 PIM-3參與胃癌組織細(xì)胞的分化、浸潤和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤惡化和癌癥發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 胃癌組織；PIM-3；異常表達(dá)

[中圖分類號] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（c）-0025-04

The abnormal expression and clinical significance of PIM-3 in gastric cancer tissue

LIU Caixia1 KANG Shirong2

1.Department of Tumor， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010059， China； 2.Department of Chest， the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010059， China

[Abstract] Objective To research research and analyze the abnormal expression and clinical significance of PIM-3 in gastric cancer tissue. Methods 50 cases of patients with gastric cancer from June 2013 to February 2014 in the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University were selected as study objects. The expression of PIM-3 in the gastric cancer patients and 25 cases of normal tissues adjacent to the 50 cases of gastric cancer tissues pIM - 3 were detected by immunohistochemical method （SP method）， the correlation between PIM-3 and related parameters such as sex， age， tumor size were analyzed（SP）. Results The PIM-3 expression in normal tissue were 16%， which was significantly lower than that of gastric cancer tissues （90%）. The expression of PIM-3 in gastric cancer tissue was closely related to the differentiation degree， infiltration degree， lymph node metastasis and venous metastasis （P < 0.05）， and had no correlation with sex， age and diameter of tumor （P > 0.05）. Conclusion The PIM-3 plays a role in the tumor in differentiation， invasion and metastasis of gastric cancer tissues and cells， and promotes the development of tumor progression and cancer.

[Key words] Gastric cancer tissue； PIM-3； Abnormal expression

胃腸道癌是最常見和最主要的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。而胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，占我國消化道腫瘤的第1位，故研究胃癌的發(fā)病機(jī)制和解決辦法對世界而言有著舉足輕重的意義。由于胃癌發(fā)病因素多樣，且具有明顯的地域性，其預(yù)后與病理分期、部位、組織類型、生物學(xué)行為以及治療措施密切相關(guān)，為了提出針對全人類的胃癌治療方案，著重于基因的研究是最佳選擇。胃癌的發(fā)展是在多種因素的作用下發(fā)展而成的，正常情況下，胃黏膜細(xì)胞的增殖與凋亡保持動態(tài)平衡，該平衡是有賴于抑癌基因和癌基因的共同調(diào)節(jié)下的平衡，一旦平衡被打破，胃黏膜上皮細(xì)胞過度增殖，則可能逐漸發(fā)展為胃癌，尤其是近年來發(fā)現(xiàn)的幽門螺旋桿菌特別是高毒性的幽門螺旋桿菌導(dǎo)致的胃黏膜損傷，由慢性胃炎、腸上皮化生、不典型增生到典型胃癌。據(jù)研究，PIM激酶是一個與哺乳動物蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶密切相關(guān)的家族，其能使促凋亡分子Bad發(fā)生磷酸化而失活，同時使抗凋亡家族Bcl-XL、Bcl-2的表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖[1-2]。PIM家族有3個成員，PIM-1、PIM-2和PIM-3，目前PIM-3在腫瘤發(fā)生中的研究主要集中在尤文肉瘤、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌及胃癌等[3-5]。本研究通過免疫組織化學(xué)SP法，分別測定PIM-3在50例胃癌組織和25例癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)，分析其與有關(guān)臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。為今后胃癌的臨床治療開辟新思路?，F(xiàn)將分析方法和結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年6月～2014年2月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行胃癌組織根治性切除的手術(shù)患者50例為研究對象，其中低分化胃癌25例，年齡38～72歲，平均（54.2±14.1）歲，男16例，女9例；高-中分化患者25例，年齡42～70歲，平均（52.8±15.1）歲，男15例，女10例。排除曾經(jīng)接受放療或者化療等方面治療的患者。隨機(jī)在50例胃癌組織周圍采集25例患者的癌旁組織，其中男15例，女10例。癌旁常組織取自患者癌組織范圍2.5 cm以外的區(qū)域，經(jīng)切片病理染色分析證實(shí)均無癌變細(xì)胞，患者的個人基本資料和腫瘤相關(guān)參數(shù)來源于我院病案室。本研究經(jīng)我院倫理委員會通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

主要試劑為羊抗人PIM-3多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）， 濃度為1∶200。①制作切片：包埋組織每份制作切片1和切片2，每片厚度約4 μm。②切片1處理：常規(guī)脫蠟至水后緩沖液沖洗3 min×2 次，Hydrogen Peroxide Block中孵育12 min，緩沖液洗5 min×2次，Ultra V Block背景染色，緩沖液洗5 min×2 次，滴加一抗工作液 37℃孵育1.5 h，緩沖液洗5 min×2次，Primary Antibody Enhancer室溫下孵育20 min，緩沖液洗5 min×2次，加辣根過氧化物酶聚合物室溫下孵育30 min，緩沖液洗5 min×2次，1 mL 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）Plus Substrate中滴加 1～2滴DAB Plus Chromogen混勻后滴加到切片上，孵育10 min，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。③切片2處理：石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育5 min，蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡5 min×2次，5%～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加一抗工作液，4℃過夜；PBS沖洗，5 min×3 次；生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育15 min；PBS 沖洗，5 min×3 次；滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min；PBS沖洗，5 min ×3次；DAB顯色劑顯色3～15 min；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。④鏡檢：每張切片選取具有代表性的5個高倍視野，計(jì)數(shù)1000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。所有標(biāo)本的組織病理學(xué)診斷均由兩名病理學(xué)專家采用盲法獨(dú)立檢測取平均值，高倍鏡下隨機(jī)觀察至少4個視野復(fù)核證實(shí)。

1.3 鏡檢結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)

陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：PIM-3陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽性細(xì)胞。依據(jù)《全國免疫組織化學(xué)技術(shù)及診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會》標(biāo)準(zhǔn)[7]，按陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行分級：<25%為陰性（-），25%～50%為弱陽性（+），>50%～75%為陽性（++），>75%為強(qiáng)陽性（+++）。以弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性來統(tǒng)計(jì)陰性率。

1.4 觀察指標(biāo)

測定PIM-3在50例胃癌組織和及其中25例患者的癌旁組織中的表達(dá)，分析PIM-3與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本中PIM-3的表達(dá)

根據(jù)鏡檢結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)，兩組標(biāo)本的鏡檢結(jié)果顯示：胃癌組織中PIM-3陽性率遠(yuǎn)高于癌旁組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=5.847，P = 0.000）。見表1。

表1 胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本中PIM-3的表達(dá)（例）

3 討論

胃癌的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)居第2位，具有發(fā)病率高達(dá)30/10萬～70/10萬，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)50%，病死率高達(dá)30/10萬的特點(diǎn)，同時早診率低于10%，根治切除率低于50%，5年生存率≤50%[8]。所以，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要，但是目前還沒有發(fā)現(xiàn)胃癌的特異性標(biāo)志物，這一難題的解決顯得十分迫切。隨著分子生物學(xué)進(jìn)展，原癌基因的研究逐漸深入，原癌基因PIM-1、PIM-2均屬PIM家族的成員，PIM家族激酶能使在細(xì)胞生長通路中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)分子殘基磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和生存，PIM-3引起惡性腫瘤發(fā)生的機(jī)制主要是使促凋亡分子Bad發(fā)生磷酸化而失活，同時使抗凋亡家族Bcl-2的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的失控生長，Bad的促凋亡活性由其蛋白質(zhì)分子內(nèi)的殘基磷酸化來調(diào)控的，非磷酸化的Bad可以結(jié)合Bcl-X也可以包括Bcl-2并使兩者失活，通過與14-3-3蛋白分離，從線粒體易位到胞漿，從而喪失了與Bcl-X、Bcl-2結(jié)合的能力，從Bad游離出來后的Bcl-X、Bcl-2則保持了線粒體膜的潛能，能阻止細(xì)胞凋亡[10-15]。PIM-3最初以大鼠細(xì)胞系PC12去極化誘導(dǎo)的基因首先報道，它在哺乳動物細(xì)胞中與PIM-1的序列具有同源性，在功能上與前二者相似，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PIM-3 mRNA在人的心臟、骨骼肌、大腦、脾臟、腎臟中存在，在心肌和骨骼肌中呈高表達(dá)，相反，在結(jié)腸、胸腺、肝臟等組織中不表達(dá)，還證實(shí)了PIM-3蛋白在人肝細(xì)胞的癌旁組織，一部分癌組織及再生的膽管細(xì)胞中表達(dá)，且在癌旁組織中的表達(dá)較癌組織中高[16-18]。從人類開始研究腫瘤開始，逐漸發(fā)現(xiàn)癌基因的異常激活和抑癌基因失活，以及環(huán)境、生活方式、情緒等多種因素都對癌癥的發(fā)生都有影響。從1997年人們發(fā)現(xiàn)PIM基因來，對該基因的研究逐漸深入。研究人員已發(fā)現(xiàn)PIM激酶家族能使促凋亡分子Bad發(fā)生磷酸化而失活，同時使抗凋亡家族Bcl-XL、Bcl-2的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的失控生長[19-21]。

本研究通過測定PIM-3在50例胃癌組織和25例胃癌癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)，分析其與有關(guān)臨床病理參數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：癌旁組織中PIM-3的表達(dá)陽性率為16%，顯著低于胃癌組織（90%），與Zheng等[22]的研究結(jié)果一致，表明PIM-3在胃癌發(fā)生機(jī)制中有著重要的決定性作用；PIM-3的表達(dá)與胃癌組織中分化程度、浸潤程度、淋巴轉(zhuǎn)移和靜脈轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P < 0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑關(guān)系不大（P > 0.05），這與胡志方等[6]的研究結(jié)果一致，說明PIM-3與胃癌的生物學(xué)行為有一定相關(guān)性，其參與胃癌組織細(xì)胞的分化、浸潤和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤惡化和癌癥發(fā)展。

綜上所述，癌旁組織中不表達(dá)PIM-3，但在癌組織里的表達(dá)明顯增高。PIM-3在癌組織中的高表達(dá)可能是胃癌某一階段的標(biāo)志物，也可能是胃癌啟動的一個環(huán)節(jié)，也可能是影響預(yù)后的重要因素。因此本研究認(rèn)為，PIM-3是一種較為理想的胃癌標(biāo)志物，而在分化較高的胃癌組織中，其表達(dá)明顯高于分化程度低的胃癌組織，從PIM-3蛋白和一些病理資料的相關(guān)性分析結(jié)果來看，PIM-3蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、浸潤程度無明顯相關(guān)性，而與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性，說明PIM-3與胃癌的生物學(xué)行為有一定的相關(guān)性，其表達(dá)是反映胃癌生物學(xué)進(jìn)展程度和腫瘤預(yù)后的標(biāo)志。由于條件所限，未能與胃腺瘤等良性疾病進(jìn)行對照研究，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量，并對胃黏膜異型增生、胃腺瘤進(jìn)行對照研究，更需要長期隨訪結(jié)合分期來明確PIM-3基因與生存的關(guān)系，從而帶來更多的診治思路及思考。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 簡捷.直腸腺癌中原癌基因Pim-3及其蛋白表達(dá)的研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2009.

[2] Fox CJ，Hammerman PS，Thompson CB. The Pim kinases control rapamycin-resistant T cell survival and activation [J]. J Exp Med，2005，201（8）：2590-2660.

[3] Manning G，Whyte DB，Martinez R，et al. The protein kinase complement of the human genome [J]. Science，2002，298（5）：1912-1934.

[4] 李小燕，朱水山，劉亮明，等.Pim-3基因的分子生物學(xué)特性及作用[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2008，24（2）：524-526.

[5] Popivanova BK，Li YY，Zheng H，et al. Proto-oncogene，PIM-3 with serine/threonine kinase activity， is aberrantly expressed in human colon cancer cells and can prevent Bad-mediated apoptosis [J]. Cancer Sci，2007，98（1）：321-328.

[6] 胡志方，黃緣，鐘瓊，等.Pim-3異常表達(dá)在胃癌中的意義[J].世界華人消化雜志，2008，16（31）：3515-3518.

[7] 中華病理學(xué)雜志編輯委員會.全國免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會會議紀(jì)要[J].中華病理學(xué)雜志，1996， 25（6）：326.

[8] 鄒小農(nóng)，陳萬青，張思維，等.中國部分市縣1998-2002胃癌發(fā)病與死亡[J].中國腫瘤，2007，16（3）：142-145.

[9] 婁清濤，全培良，陸建邦，等.河南省胃癌病死率地理分布的趨勢面分析[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，45（5）： 726-728.

[10] 任叢林，王瑞平.基于壓縮感知算法的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2013，32（2）：195-197，200.

[11] Li YY，Mukaida N. Pathophysiological roles of Pim-3 kinase in pancreatic cancer development and progression [J]. World J Gastroenterol，2014，20（28）：9392-9404.

[12] Guo Q，Lan P，Yu X，et al. Immunotherapy for hepatoma using a dual-function vector with both immunostimulatory and Pim-3-silencing effects [J]. Mol Cancer Ther，2014，13（6）：1503-1513.

[13] Wang J，Lao L，Zhao H，et al. Serine threonine kinase Pim-3 regulates STAT3 pathway to inhibit proliferation of human liver cancers [J]. Int J Clin Exp Med，2014，7（2）：348-355.

[14] Lou L，Wang Y，Cui J，et al. Differential expression of Pim-3，c-Myc，and p-p27 proteins in adenocarcinomas of the gastric cardia and distal stomach [J]. Tumour Biol，2014， 35（5）：5029-5036.

[15] Zhang F，Liu B，Wang Z，et al. A novel regulatory mechanism of Pim-3 kinase stability and its involvement in pancreatic cancer progression [J]. Mol Cancer Res，2013，11（12）：1508-1520.

[16] Wang C，Li HY，Liu B，et al. Pim-3 promotes the growth of human pancreatic cancer in the orthotopic nude mouse model through vascular endothelium growth factor [J]. J Surg Res，2013，185（2）：595-604.

[17] Xu D，Cobb MG，Gavilano L，et al. Inhibition of oncogenic Pim-3 kinase modulates transformed growth and chemosensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine [J]. Cancer Biol Ther，2013，14（6）：492-501.

[18] Wang Z，Li XM，Shang K，et al. T-18，a stemonamide synthetic intermediate inhibits Pim kinase activity and induces cell apoptosis，acting as a potent anticancer drug [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：1245-1251.

[19] Liu LM，Sun SL，Ye CG，et al. Inhibitive mechanisms of Pim-3 affecting fulminant hepatic apoptosis [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20（9）：688-692.

[20] Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al. The essential role of PIM kinases in sarcoma growth and bone invasion [J]. Carcinogenesis，2012，33（8）：1479-1486.

[21] 邵雪輝，王建國，張曉麗，等.紅外線對萎縮性胃炎大鼠PCNA及Bcl-2表達(dá)的影響[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2012， 31（1）：87-89.

[22] Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al. Aberrant Pim-3 expressionis involved in gastric adenoma-adenocarcinomasequence and cancer progression [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（1）：481-488.

（收稿日期：2014-07-28 本文編輯：任 念）

[16] Wang C，Li HY，Liu B，et al. Pim-3 promotes the growth of human pancreatic cancer in the orthotopic nude mouse model through vascular endothelium growth factor [J]. J Surg Res，2013，185（2）：595-604.

[17] Xu D，Cobb MG，Gavilano L，et al. Inhibition of oncogenic Pim-3 kinase modulates transformed growth and chemosensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine [J]. Cancer Biol Ther，2013，14（6）：492-501.

[18] Wang Z，Li XM，Shang K，et al. T-18，a stemonamide synthetic intermediate inhibits Pim kinase activity and induces cell apoptosis，acting as a potent anticancer drug [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：1245-1251.

[19] Liu LM，Sun SL，Ye CG，et al. Inhibitive mechanisms of Pim-3 affecting fulminant hepatic apoptosis [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20（9）：688-692.

[20] Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al. The essential role of PIM kinases in sarcoma growth and bone invasion [J]. Carcinogenesis，2012，33（8）：1479-1486.

[21] 邵雪輝，王建國，張曉麗，等.紅外線對萎縮性胃炎大鼠PCNA及Bcl-2表達(dá)的影響[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2012， 31（1）：87-89.

[22] Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al. Aberrant Pim-3 expressionis involved in gastric adenoma-adenocarcinomasequence and cancer progression [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（1）：481-488.

（收稿日期：2014-07-28 本文編輯：任 念）

[16] Wang C，Li HY，Liu B，et al. Pim-3 promotes the growth of human pancreatic cancer in the orthotopic nude mouse model through vascular endothelium growth factor [J]. J Surg Res，2013，185（2）：595-604.

[17] Xu D，Cobb MG，Gavilano L，et al. Inhibition of oncogenic Pim-3 kinase modulates transformed growth and chemosensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine [J]. Cancer Biol Ther，2013，14（6）：492-501.

[18] Wang Z，Li XM，Shang K，et al. T-18，a stemonamide synthetic intermediate inhibits Pim kinase activity and induces cell apoptosis，acting as a potent anticancer drug [J]. Oncol Rep，2013，29（3）：1245-1251.

[19] Liu LM，Sun SL，Ye CG，et al. Inhibitive mechanisms of Pim-3 affecting fulminant hepatic apoptosis [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012，20（9）：688-692.

[20] Narlik-Grassow M，Blanco-Aparicio C，Cecilia Y，et al. The essential role of PIM kinases in sarcoma growth and bone invasion [J]. Carcinogenesis，2012，33（8）：1479-1486.

[21] 邵雪輝，王建國，張曉麗，等.紅外線對萎縮性胃炎大鼠PCNA及Bcl-2表達(dá)的影響[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程，2012， 31（1）：87-89.

[22] Zheng HC，Tsuneyama K，Takahashi H，et al. Aberrant Pim-3 expressionis involved in gastric adenoma-adenocarcinomasequence and cancer progression [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（1）：481-488.

（收稿日期：2014-07-28 本文編輯：任 念）