伍桃英 程云輝 曾知音 歐陽林 趙良忠

（1.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2.邵陽學(xué)院生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽 422000；3.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，湖南 邵陽 422000）

乳糖酶缺乏和乳糖不耐受癥是一個(gè)世界性的問題，目前解決這個(gè)問題的方法主要是飲用酸奶和低乳糖奶制品［1］。酸奶中的乳酸菌能使牛奶中乳糖部分水解［2］，但是酸奶的保質(zhì)期短，需要冷鏈儲運(yùn)、銷售，生產(chǎn)成本高，因此，利用外源性β-半乳糖苷酶制備低乳糖奶被視為最有效的方法［3，4］。低乳糖生產(chǎn)過程中，乳糖被分解為葡萄糖和半乳糖，一方面增加了甜度，賦予低乳糖奶良好的口感和風(fēng)味；另一方面，大量還原糖中的羰基與賴氨酸中的氨基結(jié)合發(fā)生美拉德反應(yīng)易導(dǎo)致產(chǎn)品褐變［5］，因此，抑制低乳糖奶的褐變成為生產(chǎn)低乳糖奶的關(guān)鍵技術(shù)之一。

本研究擬利用β－半乳糖苷酶水解生產(chǎn)低乳糖奶，采用紫外分光光度法測定美拉德反應(yīng)的主要中間產(chǎn)物5-HMF的含量，并以此為依據(jù)對6種褐變抑制劑進(jìn)行篩選，同時(shí)結(jié)合滅菌條件，對其進(jìn)行正交優(yōu)化，研究褐變抑制劑的添加量與5-HMF的關(guān)系，旨在生產(chǎn)出營養(yǎng)與感官俱佳的低乳糖奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉：湖南亞華乳業(yè)有限公司；

β－半乳糖苷酶：Lactozyme，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；

5－羥甲基糠醛：優(yōu)級純，北京百靈威科技有限公司；

乙二胺四乙酸二鈉：分析純，Sanland-chem International Inc.；

亞硫酸鈉：分析純，長沙市國營延風(fēng)化學(xué)試劑廠；

亞硫酸氫鈉：分析純，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；

Vc：分析純，衡陽市凱信化工試劑有限公司；

L－半胱氨酸：生物試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

檸檬酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV754N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

臺式pH計(jì)：Delta320型，上海君達(dá)儀器儀表有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

可調(diào)式移液槍（20～200μL）：Finnpipette型，熱電（上海）儀器有限公司；

電熱恒溫干燥箱：CS202型，重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程 利用乳糖酶水解復(fù)原乳中的乳糖，制備低乳糖奶，工藝流程：

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）配制復(fù)原乳：以全脂奶粉∶水（1∶7）的比例配制成復(fù)原乳，采用碘量法［6］測定乳糖含量。

（2）乳糖水解：復(fù)原乳經(jīng)95℃/15s殺菌后冷卻到適宜溫度，添加1.50‰（［E］/［S］）的β－半乳糖苷酶，于38.15℃水解3.0h制備低乳糖奶，乳糖水解率α按式（1）計(jì)算。

式中：

α——乳糖水解率，%；

cs——Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；

c0——單質(zhì)碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

V0——測定時(shí)準(zhǔn)確移取的單質(zhì)碘的體積，mL；

V1、V2——分別為水解前、后牛奶濾液消耗Na2S2O3的體積，mL。

（3）添加褐變抑制劑：褐變抑制劑加入過早會影響乳糖酶的活性，加入過晚起不到褐變抑制的效果，擬在水解結(jié)束前20min加入一定量的褐變抑制劑溶液。

1.3.3 紫外分光光度法測定5-HMF的含量

（1）5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取一定量的5-HMF配成標(biāo)準(zhǔn)品儲藏液，并用水稀釋成0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，用紫外分光光度計(jì)測定其2 85nm波長下的吸光值（OD285）［7］。

（2）樣品中5-HMF含量的測定：用Pb（Ac）2與COOKNa2HPO4作為乳品中蛋白質(zhì)沉淀劑，取樣品預(yù)處理后的濾液或?yàn)V液的稀釋液，用紫外可見分光光度計(jì)測其吸光值OD285。褐變抑制率的計(jì)算公式見式2。

式中：

γ——褐變抑制率，%；

xa——未添加褐變抑制劑樣品中5-HMF的含量，μ g/mL；

xb——添加了褐變抑制劑樣品中5-HMF的含量，μ g/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 低乳糖奶中乳糖的水解率

以全脂奶粉∶水（1∶7）的比例配制成復(fù)原乳，復(fù)原乳中的乳糖含量為4.82%。在滅菌后的復(fù)原乳中添加β－半乳糖苷酶對其進(jìn)行水解，經(jīng)測定，低乳糖奶其水解率達(dá)92.67%。

2.2 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線

以5-HMF的濃度為橫坐標(biāo)、吸光值OD285為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of 5-hydroxymethylfurfural

由圖1可知，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.123 7x，R2＝0.999 8，5-HMF濃度（x）與吸光值（y）相關(guān)性良好。

2.3 單一褐變抑制劑的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)［8～10］，選擇 Na2SO3、NaHSO3、Vc、EDTA-2Na、L-半胱氨酸、檸檬酸6種物質(zhì)作為褐變抑制劑，加入量以其占牛乳的體積百分比表示（%，m/V），以未加褐變抑制劑的低乳糖奶樣品為空白，用紫外分光度法檢測5-HMF，研究不同褐變抑制劑對褐變抑制率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同種類的褐變抑制劑對褐變抑制率的影響Figure 2 The anti-browning effect of different types of browning inhibitors

5-HMF的積累與褐變有很大的相關(guān)性，其濃度越小，褐變抑制率越大，說明褐變抑制效果越好。由圖2可知：Na2SO3、EDTA-2Na、NaHSO3、檸檬酸對5-HMF有不同程度的抑制作用，而在低乳糖奶中，Vc和L－半胱氨酸對5-HMF的生成有促進(jìn)作用，具體如下：

（1）Na2SO3對5-HMF的抑制效果隨其濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)其用量在0.01%～0.20%時(shí)，褐變抑制率從0.73%線性增長至11.69%。Na2SO3具有抑制褐變效果主要由于它能不可逆地與醌生成無色的加成產(chǎn)物，且具有抑制微生物生長的作用，這對低乳糖奶的生產(chǎn)有利。

（2）NaHSO3在0.01%～0.10%范圍內(nèi)對低乳糖奶中5－HMF的抑制效果隨用量的增加而遞增；當(dāng)NaHSO3大于0.10%時(shí)，NaHSO3對5-HMF的抑制效果增幅開始減小。這是由于NaHSO3的抗褐變機(jī)理是其吸水后，釋放出SO2，生成亞硫酸，亞硫酸能與許多有色物質(zhì)發(fā)生加成反應(yīng)形成加成物，使有色物失去雙鍵或減少雙鍵，同時(shí)亞硫酸還可以將某些生色基團(tuán)封閉起來，避免生色反應(yīng)的發(fā)生，因而NaHSO3具有褐變抑制效果；但亞硫酸易分解，因此即使持續(xù)增加NaHSO3的用量，而體系中的亞硫酸并未繼續(xù)增加，所以對5-HMF的抑制效果并不會持續(xù)上升。

（3）Vc是一種水溶性維生素，在氧化還原中能起調(diào)節(jié)作用。在此研究中，Vc對低乳糖奶中5-HMF不僅沒有產(chǎn)生抑制作用，反而具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。這是由于Vc在溶液中加熱自身容易氧化分解，生成的己糖加速了Maillard反應(yīng)進(jìn)程［11］。

（4）EDTA-2Na對5-HMF的抑制效果隨著濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢。當(dāng)EDTA-2Na的用量在0.01%～0.10%，褐變抑制率由1.09%快速上升至7.67%；當(dāng)EDTA-2Na大于0.10%時(shí)，對5-HMF的抑制效果開始減弱。這是由于EDTA-2Na不僅能與促進(jìn)褐變的金屬離子螯合，還能與乳及乳制品中的鈣離子反應(yīng)，當(dāng)EDTA-2Na的用量過多時(shí)，EDTA-2Na不僅能結(jié)合游離鈣，而且能從膠體磷酸鈣、酪蛋白中爭奪鈣離子，破壞乳體系原有的膠體平衡，從而加速了褐變的發(fā)生［12］。

（5）在0.01%～0.125%范圍內(nèi)，檸檬酸對5-HMF的抑制效果呈拋物線變化趨勢。當(dāng)檸檬酸用量小于0.075%時(shí)，對5-HMF的褐變抑制率呈上升趨勢；當(dāng)其用量大于0.075%時(shí)，對5-HMF的褐變抑制率開始下降。由此可知，低濃度的檸檬酸對低乳糖奶中5-HMF起抑制作用，而高濃度的檸檬酸促進(jìn)5-HMF的生成。

（6）L-半胱氨酸屬于含硫氨基酸。L-半胱氨酸在濃度為0.004%附近時(shí)，對5-HMF有微弱的抑制效果；在其他濃度反而具有較大的促進(jìn)作用，因此，不選用L-半胱氨酸作為低乳糖奶的褐變抑制劑。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與牛樂寶等［13］研究結(jié)果相吻合，在后者研究的褐變抑制劑配方中，L-半胱氨酸的添加量為0g/kg。

2.4 褐變抑制劑加入時(shí)間的研究

為了探索褐變抑制劑是否影響乳糖酶的水解作用，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在水解開始的0，40，80，160min 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入褐變抑制劑，考察0.2%Na2SO3、0.1%EDTA-2Na、0.1%NaHSO3、0.075%檸檬酸對乳糖水解率和褐變抑制率的影響，確定最佳添加時(shí)間。

2.4.1 加入時(shí)間對乳糖水解率的影響 褐變抑制劑的加入導(dǎo)致pH值的變化會影響乳糖酶的水解效果。由表1可知，褐變劑加入時(shí)間越晚，乳糖的水解率越大，這是由于乳糖酶的酶活力受褐變抑制劑的影響，從而反應(yīng)在乳糖的水解率上。因此，為保證乳糖水解率達(dá)到90%，褐變抑制劑加入的時(shí)間接近水解結(jié)束的時(shí)間較好。

表1 加入時(shí)間對乳糖水解率的影響Table 1 Effect of added time on the hydrolysis rate of lactose /%

2.4.2 加入時(shí)間對褐變抑制率的影響 體系中5-HMF的濃度是考察各褐變抑制劑抑制效果的重要指標(biāo)，其濃度越低，說明褐變劑的抑制效果越好，抑制率也就越大。由表2可知，隨著各種褐變劑加入時(shí)間的延后，其抑制率皆逐漸增大。

綜上所述，褐變抑制劑加入的時(shí)間越晚，對牛乳體系pH和乳糖水解率的影響越小，由于褐變抑制劑過早加入并未提高褐變抑制率，因此，在反應(yīng)體系結(jié)束水解前20min加入即可。這與李杰［14］的觀點(diǎn)相同。

表2 加入時(shí)間對褐變抑制率的影響Table 2 Effect of added time on the anti-browning rate/%

2.5 復(fù)配褐變抑制劑的研究與驗(yàn)證

根據(jù)單一褐變抑制劑的試驗(yàn)結(jié)果，選擇EDTA-2Na、檸檬酸、Na2SO3、NaHSO34種（表3）褐變抑制效果較好的褐變抑制劑進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

由表4可知，以褐變抑制率為考察指標(biāo)，4個(gè)因素的主次關(guān)系是C＞B＞D＞A，較優(yōu)方案為C4B2D2A3，即0.20%Na2SO3＋0.025% 檸 檬 酸 ＋0.05%NaHSO3＋0.075%EDTA-2Na。

對C4B2D2A3復(fù)配方案進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)合殺菌溫度考察其褐變抑制效果，結(jié)果見表5。

表3 L16（44）正交設(shè)計(jì)Table 3 L16（44）orthogonal design

表4 L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal test L16（45）

表5 復(fù)配褐變抑制劑的驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Verify results of compound browning inhibitor

由表5可知，殺菌溫度越高，復(fù)配褐變抑制劑的褐變效果越明顯，當(dāng)殺菌溫度為100℃時(shí)，其褐變抑制率將近40%。

3 結(jié)論

采用β－半乳糖苷酶制備的低乳糖奶其乳糖水解率超過90%，針對于低乳糖奶的褐變，篩選出了Na2SO3、檸檬酸、NaHSO3、EDTA-2Na 4種效果相對較好的褐變抑制劑，在水解結(jié)束前20min加入褐變抑制即可。對褐變抑制劑進(jìn)行復(fù)配，正交優(yōu)化得到的較優(yōu)配比為0.20%Na2SO3＋0.025%檸檬酸＋ 0.05%NaHSO3＋ 0.075%EDTA-2Na，配合1 0min/100℃的殺菌條件，其褐變抑制率將近40%，說明本試驗(yàn)所研究的復(fù)配褐變抑制劑具有明顯的褐變抑制效果，對生產(chǎn)具有理論指導(dǎo)，有利于促進(jìn)低乳糖奶的進(jìn)一步發(fā)展。

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