李 讓 魯 軍 陳劍婷 袁 悅 田 漫 任迪峰

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品系北京市林業(yè)食品加工與安全重點實驗室，北京 100083；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015）

地木耳（Nostoccommune）又名地皮菜、葛仙米、地耳等，屬原核生物界、藍藻門、念珠藻屬的單細胞陸生固氮藍藻，是一種高蛋白、低脂肪的綠色食品，蛋白質(zhì)含量一般占干重的14.6%～21.81%，是很好的蛋白質(zhì)來源［1－3］。其組分中的藻藍蛋白（PC），不僅可作為食品著色劑和熒光探針，同時對于自由基的清除和特異性免疫功能的提高也有促進作用，有較大的應(yīng)用價值［4，5］。地木耳蛋白質(zhì)中氨基酸結(jié)構(gòu)比例與人體需要量相近，長期食用可提高機體免疫力［6，7］。傳統(tǒng)的地木耳蛋白質(zhì)提取方法主要有溶劑法和堿法，但因存在提取溶劑不易去除、提取率低和生產(chǎn)成本較高等缺點［8－10］，使得地木耳中的蛋白質(zhì)尚未被充分開發(fā)利用。

從顯微結(jié)構(gòu)看，地木耳部分藻絲存在膠鞘包裹、細胞壁成分復(fù)雜、破壁難度較大［11］等問題。而地木耳中蛋白質(zhì)主要存在于胞內(nèi)，因此提取關(guān)鍵技術(shù)在于破壁［5］。有研究［12］采用溶菌酶添加少量纖維素酶和果膠酶進行原核藻類處理，破壁效果較好。同時一些蛋白質(zhì)或多糖提取的研究［13－15］表明，采用酶解方法，再結(jié)合反復(fù)凍融溫和破壁，可避免高溫對原料造成營養(yǎng)損失等不良影響。另有研究［16－21］采用超聲波輔助處理藻類或其他植物原料，利用其產(chǎn)生的空化及機械作用加速細胞壁的破碎，促進蛋白質(zhì)溶出，提高蛋白質(zhì)提取效率。

基于以上眾多研究成果可以發(fā)現(xiàn)，整合酶解、凍融以及超聲波輔助法進行植物原料的細胞破碎將是一種很好的地木耳蛋白質(zhì)提取優(yōu)化思路。本研究擬以蛋白質(zhì)提取率為指標，結(jié)合酶解、凍融和超聲波法進行細胞破碎，探究地木耳蛋白質(zhì)的提取條件，并通過響應(yīng)面法對提取參數(shù)進行優(yōu)化，旨在為地木耳蛋白質(zhì)的進一步開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

地木耳片：山西汾陽市迅達土特產(chǎn)品有限責(zé)任公司；

牛血清白蛋白（BSA）：生物試劑，美國Amresco公司；

考馬氏亮藍G-250：生物試劑，天津市博迪化工有限公司；

果膠酶：活力單位＞10kU/g solid，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

纖維素酶：活力單位為10kU/g solid，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

溶菌酶：活力單位＞20kU/mg，上海前塵生物科技有限公司；

液氮：中科院半導(dǎo)體研究所；

磷酸、乙醇：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凱氏定氮儀：KDY-9830型，北京市通潤源機電技術(shù)有限責(zé)任公司；

超聲波細胞粉碎機：JAC-IV型，濟寧市奧波超聲波電氣有限公司；

低速離心機：LD4-2型，北京醫(yī)用離心機廠；

數(shù)顯溫控儀：XMTB型，余姚市東方電工儀器廠；

紫外可見分光光度計：725型，上海美譜達儀器有限公司；

臺式恒溫振蕩器：TS-100B型，上海天呈實驗儀器制造有限公司；

電子天平：FA2004-N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 地木耳蛋白質(zhì)提取工藝

地木耳干片→粉碎→80目過篩→稱量→料液混勻→液氮凍融→組合酶酶解（0.1%溶菌酶、0.05%纖維素酶、0.05%果膠酶，55℃酶解1h）→滅酶（80℃，15min）→超聲波處理→離心分離（4 000r/min，15min）→測定蛋白質(zhì)提取率

1.3.2 地木耳總蛋白含量的測定 根據(jù)GB 5009.5—2010，采用微量凱氏定氮法測定地木耳蛋白質(zhì)的總量。

1.3.3 地木耳的可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍G-250蛋白質(zhì)染色法在595nm處測定可溶性蛋白質(zhì)含量［22］。按式（1）計算可溶性蛋白質(zhì)提取率：

1.3.4 超聲波破碎條件單因素試驗設(shè)計

（1）時間對地木耳蛋白質(zhì)提取率的影響：料液比為1∶30（m∶V），超聲功率600W，超聲時間分別為10，15，20，25，30min，以可溶性蛋白質(zhì)的提取率為指標，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質(zhì)的提取率。

（2）功率對地木耳蛋白質(zhì)提取率的影響：料液比為1∶30（m∶V），超聲時間25min，超聲功率分別為200，400，600，800，1 000W，以可溶性蛋白質(zhì)的提取率為指標，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質(zhì)的提取率。

（3）料液比對地木耳蛋白質(zhì)提取率的影響：超聲功率為800W，超聲時間25min，料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（m∶V）。以可溶性蛋白質(zhì)的提取率為指標，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質(zhì)的提取率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法 利用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，獲得數(shù)學(xué)模型，對響應(yīng)值進行回歸分析、方差分析，用F檢驗判定回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，得出超聲波各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對蛋白質(zhì)含量的影響 由圖1可知，在2 5min前，隨著時間的延長，溶液中的可溶性蛋白含量不斷增加，說明地木耳細胞壁在超聲波的反復(fù)作用下出現(xiàn)明顯破損，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)被釋放出來，蛋白質(zhì)肽鏈間被破壞的二硫鍵的量不斷增大，直到2 5min時，達到飽和；當提取時間超過25min后，溶液中蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能是因為隨著時間的延長，產(chǎn)生的熱量過多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低，引起蛋白質(zhì)分解。綜上分析可得，較佳的提取時間為25min。

圖1 提取時間對蛋白提取率的影響Figure 1 Effect of extraction time on protein content

2.1.2 提取功率對蛋白質(zhì)含量的影響 由圖2可知，在8 00W前，隨著提取功率的增長，超聲波振動空化、機械粉碎、攪拌等作用，使組織中的細胞破裂，利于溶劑滲透到細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)含量逐漸增加。當提取功率超過8 00W，由于超聲提取功率過大，溫度迅速升高會破壞蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)提取率，使得溶液中蛋白質(zhì)含量逐漸降低。綜上可得，較佳的提取功率為800W。

圖2 超聲功率對蛋白質(zhì)提取率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic power on protein content

2.1.3 料液比的影響 料液比越大，即溶劑體積越大，則溶劑中可以容納的有效成分越多。料液比對蛋白質(zhì)提取的影響見圖3，當料液比達到1∶40（m∶V）時，蛋白質(zhì)含量不再繼續(xù)提高，說明此時地木耳蛋白質(zhì)中肽鏈間被破壞的二硫鍵的量達到最大。再增加水量，不能顯著破壞肽鏈間的二硫鍵，溶液中蛋白質(zhì)含量無明顯變化，隨著所加水量增加到一定程度，濃度過小使得摩擦破碎不完全，蛋白質(zhì)濃度反而降低［23］。由圖3可知，料液比1∶40（m∶V）為最佳條件。

圖3 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Figure 3 Effect of ratio of material to liquid on protein content

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗的設(shè)計與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗的設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取時間、功率和料液比3個因素作試驗因素，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，借助Design-Expert 8.0.5Trial軟件對提取條件進行分析優(yōu)化，試驗因素及水平見表1。

2.2.2 地木耳優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果 地木耳優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

表2 地木耳提取優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Optimization of fermentation conditions design and results of experimental design

2.2.3 模型的建立與顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計軟件進行試驗數(shù)據(jù)二次多項回歸擬合，獲得蛋白質(zhì)提取率（Y）對自變量時間、功率、料液比的多元回歸方程：

對該模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型P＜0.01，失擬項P＝0.620 7＞0.05，說明該模型極顯著，失擬項不顯著，殘差主要由隨機誤差引起；同時復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.927 8，Radj2＝0.834 9，說明該模型對試驗的擬合情況良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。由此可得，應(yīng)用該回歸方程分析和預(yù)測試驗結(jié)果具有可行性［24］。

分析表3可得出，交互項AB、BC與二次項A2、C2均達到顯著水平（P＜0.05）。另外，通過F值的大小，可以推斷在選定的試驗范圍內(nèi)各因素對試驗結(jié)果的重要性，F(xiàn)值越大，其重要性越大［25］，在所選的各因素范圍內(nèi)，各因素對結(jié)果的影響大小順序為：功率＞時間＞料液比。

2.2.4 最優(yōu)酶解參數(shù)的確定 Design-expert 8.0.5軟件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計分析優(yōu)化結(jié)果見圖4～6。

表3 試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Test result of regression analysis

圖4 提取時間超聲功率對地木耳蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 4 The response surface figure about the effect of extraction time and ultrasonic poweron protein content

圖5 超聲功率料液比對地木耳蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 5 The response surface figure about the effect of ultrasonic power and ratio of material to liquid on protein content

圖6 提取時間料液比對地木耳蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 6 The response surface figure about the effect extraction time and ratio of material to liquid on protein content

由圖4可知，料液比固定在零水平的條件下，蛋白質(zhì)的提取率隨時間的增大先提高后降低。前期地木耳蛋白質(zhì)提取率的增加可能是因為超聲波一旦與體系組分接觸，即刻產(chǎn)生空化效應(yīng)，地木耳細胞壁得到充分破碎，從而使得蛋白質(zhì)分子的溶出能力增加。而超聲時間和超聲功率增加到一定的數(shù)值時，蛋白質(zhì)的某些次級鍵受到破壞而變性，從而使得蛋白質(zhì)的溶解度下降。此等高線是橢圓型的，但是并不密集，可說明超聲時間和超聲功率交互作用顯著。

由圖5可知，時間固定在零水平的條件下，增加料液比會使蛋白質(zhì)的提取率先增加后降低，增加超聲功率使提取率緩慢增加。等高線逐漸靠近并呈現(xiàn)橢圓，這說明料液比和功率的交互作用顯著。由圖6可知，功率固定在零水平的條件下，地木耳蛋白質(zhì)提取率隨著料液比和超聲時間的增加呈現(xiàn)的是先增加后降低的趨勢，并且料液比增加的幅度大于超聲時間增加引起的幅度。料液比過大，會使得溶液濃度過小，超聲產(chǎn)生的機械作用不能均勻地作用于地木耳細胞，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)提取率的降低。二者等高線是圓形的，可說明超聲時間和料液比交互作用并不明顯。

2.2.5 最佳提取工藝的確定及模型驗證 借助分析軟件可直接得出最優(yōu)提取工藝為：時間27.49min、功率1 000W、料液比1∶41.93（m∶V），最佳提取率為17.85%。但從試驗的可行性考慮，將最優(yōu)工藝調(diào)整為：時間27.5min、功率1 000W、料液比1∶42（m∶V）。為了驗證響應(yīng)面法所得結(jié)果的準確性，進行3次平行驗證實驗，所得實際蛋白質(zhì)平均提取率為17.24%，相對偏差3.41%。由此可說明，響應(yīng)面法所優(yōu)化的總蛋白提取條件與實際試驗結(jié)果相近，參考作用與試驗價值較高。

3 結(jié)論

本試驗采用酶解、凍融及超聲法聯(lián)合處理地木耳材料的方法，并對影響地木耳蛋白質(zhì)提取率的因素：時間、功率及料液比進行了研究，在此基礎(chǔ)上利用Box-Behnken試驗設(shè)計方案和響應(yīng)面分析建立了回歸方程。由F檢驗得到因子貢獻率為功率＞時間＞料液比。通過Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面法建立三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，得到最優(yōu)條件為：時間27.5min、功率1 000W和料液比1∶42（m∶V），此工藝下的提取率為17.24%，通過驗證實驗，證實了該模型的可行性，對地木耳蛋白的進一步開發(fā)利用提供了良好的基礎(chǔ)。本研究下一步擬在抗氧化活性等方面對本法提取的地木耳蛋白質(zhì)進行探究，以期為地木耳蛋白質(zhì)在功能性食品開發(fā)等應(yīng)用中起到推動作用。

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