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        紫蘇葉中總黃酮的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化

        2014-12-21 01:43:22陳洪彬鄭金水蔡英卿張晨曦陳明賢泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院福建泉州3600福建省泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所福建泉州36分子生物學(xué)與藥物化學(xué)福建省高校重點實驗室福建泉州3600
        食品與機械 2014年5期
        關(guān)鍵詞:紫蘇葉中總液料

        陳洪彬 鄭金水 蔡英卿 張晨曦 陳明賢(.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,福建 泉州 3600;.福建省泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,福建 泉州 36;3.分子生物學(xué)與藥物化學(xué)福建省高校重點實驗室,福建 泉州 3600)

        紫蘇(Perilla frutescensL.)又名紅蘇、香蘇、蘇草、桂荏等,為唇形科(Lamiaceae)紫蘇屬(Perilla)下唯一種,是藥食兼用的一年生草本植物,主產(chǎn)于東南亞以及中國的臺灣、江西、湖南等?。?,2]。紫蘇葉中富含紫蘇醛、紫蘇醇、左旋檸檬烯等揮發(fā)性油和迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸類以及芹菜素、木犀草素等黃酮類物質(zhì),具有解熱鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤、降脂保肝、增強機體免疫能力等功效,也廣泛用作烹飪風味調(diào)料[2-5]。國內(nèi)外研究中有關(guān)總黃酮的提取 方 法 主 要 有 水 浴 浸 提[6]、微 波 輔 助[7,8]、超 聲 波 輔助[9,10]、微波—超聲波協(xié)同輔助[11]、超臨界 CO2流體萃?。?2]等,超聲波輔助提取通過其機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng),增大介質(zhì)分子的運動頻率和速度,增強介質(zhì)的穿透力,可有效增加總黃酮的提取率,降低成本[10]。目前,有關(guān)紫蘇葉中的化學(xué)成分研究主要集中在其揮發(fā)性精油[1,5],對其黃酮類成分的研究較少且集中在抗氧化活性評價方面,對其提取工藝優(yōu)化較少深入研究[7-9]。本研究擬以紫蘇葉為試驗材料,采用超聲波輔助乙醇提取法提取總黃酮,通過單因素試驗及響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉中總黃酮的提取工藝,以期為紫蘇葉的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料、儀器與試劑

        材料:紫蘇葉采自福建泉州市農(nóng)科所園區(qū),60℃烘干后粉碎至80目備用;

        數(shù)顯鼓風干燥箱:GZX-9240MBE型,上海博迅實業(yè)有限公司;

        萬能粉碎機:ZN-02型,北京興時利合科技發(fā)展有限公司;

        電子天平:BS124S型,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;

        雙頻數(shù)控超聲波清洗器:KQ-300VDE型,300W,昆山超聲儀器有限公司;

        冷凍高速離心機:TGL-16G型,上海安亭科學(xué)儀器廠;

        可見分光光度計:V-1100型,上海美譜達儀器有限公司;

        蘆丁標準品:生物級,上海金穗生物科技有限公司;

        亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 工藝流程

        紫蘇葉→60℃恒溫干燥→粉碎、過80目篩→超聲波輔助提取→離心→定容→檢測

        1.2.2 標準曲線制作 參考王艷麗等[11]的方法,以蘆丁為標品,采用NaNO2—Al(NO3)3顯色法制作標準曲線,得到蘆丁標準曲線回歸方程為:y= 0.886x+ 0.007(R2= 0.995),其中y為黃酮溶度(mg/mL),x為吸光值。

        1.2.3 總黃酮含量的測定 參考王艷麗等[11]的方法,采用NaNO2—Al(NO3)3顯色法測定提取液中總黃酮的含量,并根據(jù)標準曲線計算黃酮濃度及提取率。

        式中:

        Y——紫蘇葉總黃酮提取率,%;

        C——測定樣液黃酮濃度,mg/mL;

        V0——提取液總體積,mL;

        n——稀釋倍數(shù);

        V1——測定吸取樣液體積,mL;

        m——稱取紫蘇葉干粉末質(zhì)量,g。

        1.2.4 單因素試驗設(shè)計

        (1)液料比對總黃酮提取率的影響:在超聲時間3 0min,超聲功率300W,乙醇濃度60%,提取溫度60℃下,液料比分別為10∶1,20∶1,3 0∶1,40∶1,50∶1,60∶1(V∶m),考察總黃酮的提取率。

        (2)超聲時間對總黃酮提取率的影響:在超聲功率3 00W,乙醇濃度60%,提取溫度60℃,液料比20∶1(V∶m)下,超聲時間分別為10,20,30,40,50min,考察總黃酮的提取率。

        (3)乙醇濃度對總黃酮提取率的影響:在超聲時間3 0min,超聲功率300W,提取溫度60℃,液料比20∶1(V∶m)下,乙醇濃度分別為20%,40%,60%,80%,100%,考察總黃酮的提取率。

        (4)提取溫度對總黃酮提取率的影響:在超聲時間3 0min,超聲功率300W,乙醇濃度60%,液料比20∶1(V∶m)下,提取溫度分別為30,40,50,60,70℃,考察總黃酮的提取率。

        1.2.5 提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理,以紫蘇葉總黃酮提取率為響應(yīng)值,選取液料比、超聲時間、乙醇濃度、提取溫度4個影響因素,利用Design-Expert 8.05軟件設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面試驗。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

        2.1.1 液料比對紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1(a)可知:隨著液料比從10∶1(V∶m)到20∶1(V∶m),總黃酮提取率逐漸增加,在液料比為20∶1(V∶m)時,紫蘇葉總黃酮提取率最高;當液料比超過20∶1(V∶m)后,總黃酮提取率逐漸下降。這是因為:液料比較低時,紫蘇葉中總黃酮的浸出率降低;而液料比較高時,浸提液中總黃酮的濃度低,大大降低了后續(xù)濃縮的效率。故確定提取過程最佳液料比為2 0∶1(V∶m)。

        2.1.2 超聲時間對紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1(b)可知:隨著超聲時間的增加,紫蘇葉中總黃酮提取率逐漸增加,超聲時間40min后增加幅度減少。雖然超聲浸提時間越長,總黃酮提取率越高,但也會增加其他高分子雜質(zhì)的浸出,不利于后續(xù)對紫蘇葉黃酮類物質(zhì)的分離。故確定提取過程最佳超聲時間為30min。

        2.1.3 乙醇濃度對紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1(c)可知:隨著乙醇濃度從20%到40%,紫蘇葉總黃酮提取率增加,在乙醇濃度為40%時,紫蘇葉中總黃酮提取率最高。當乙醇濃度超過40%后,總黃酮提取率逐漸下降。這是因為:紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)以木犀草素為主,且多與糖苷結(jié)合在一起,水溶性相比其他游離黃酮高。同時,過高的乙醇濃度會增加紫蘇葉中葉綠素等脂溶性色素的浸出,干擾因素增加,不利于后續(xù)對紫蘇葉黃酮類物質(zhì)的進一步分離。故確定提取過程最佳乙醇濃度為40%。

        2.1.4 提取溫度對紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1(d)可知:隨著提取溫度的提高,紫蘇葉總黃酮提取率逐漸提高,在提取溫度為50℃時,紫蘇葉總黃酮提取率最高,之后有所下降。這是因為:過高的溫度會使提取溶劑中的乙醇濃度降低,減少紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)的浸出,也會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。故確定最佳提取溫度為50℃。

        2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

        圖1 液料比、超聲時間、乙醇濃度和提取溫度對紫蘇葉總黃酮提取率的影響Figure 1 Effects ofliquid-material ratio,ultrasonic times,ethanol concentration,extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from Perilla frutescens leaves

        2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,分別選取液料比、超聲時間、乙醇濃度、提取溫度4個因素,每個因素3個水平,以總黃酮提取率作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計的響應(yīng)值(表1)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2。

        表1 因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

        表2 紫蘇葉中總黃酮提取響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

        利用Design-Expert 8.05軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果(表2)進行分析,得到以紫蘇葉總黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值的回歸方程:

        對回歸方程進行方差分析,檢驗回歸方程的有效性及各因素對紫蘇葉總黃酮提取率的影響程度,結(jié)果見表3。由表3可知,回歸模型P<0.0001,說明回歸模型達到極顯著水平;失擬項P=0.126 3>0.05,不顯著,說明該模型合適;信噪比(Adeq Precision)=17.59>4,說明模型與試驗值擬合度很好;回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.956 4,校正決定系數(shù)=0.912 9,說明該方程擬合度較高,可利用該模型對紫蘇葉總黃酮的提取率進行分析和預(yù)測。進一步分析可知,A、C及C2項對紫蘇葉總黃酮提取率的影響極顯著(P<0.01),A2、B2及AC項對紫蘇葉總黃酮提取率的影響顯著(P<0.05),其他項對紫蘇葉總黃酮提取率的影響不顯著(P>0.05)。在所選的因素水平范圍內(nèi),各因素對紫蘇葉總黃酮提取率的影響大小為:C>A>B>D,即:乙醇濃度>液料比>超聲時間>提取溫度。

        表3 方差分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model

        表3 方差分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model

        *表示差異顯著,P<0.05;**表示極差異顯著,P<0.01。R2=0.956 4,=0.912 9,Adeq Precision=17.59。

        項目 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 41.045 919 46 14 2.931 851 21.968 78 <0.000 1 1.868 375 001 14 0.133 455失擬項 1.670 283 68 10 0.167 028 3.372 755 0.126 3 不顯著純誤差 0.198 091 321 4 0.049 523總和**A 7.041 528 462 1 7.041 528 52.763 18 <0.000 1 **B 0.043 534 315 1 0.043 534 0.326 209 0.577 0 C 15.969 762 65 1 15.969 76 119.663 7 <0.000 1 **D 0.036 435 595 1 0.036 436 0.273 017 0.609 5 AB 0.030 829 323 1 0.030 829 0.231 009 0.638 2 AC 0.814 194 736 1 0.814 195 6.100 877 0.027 0 *AD 0.042 976 499 1 0.042 976 0.322 029 0.579 4 BC 0.054 610 75 1 0.054 611 0.409 206 0.532 7 BD 0.026 715 295 1 0.026 715 0.200 182 0.661 4 CD 0.040 327 021 1 0.040 327 0.302 176 0.591 2 A2 0.849 094 69 1 0.849 095 6.362 387 0.024 4 *B2 0.933 169 581 1 0.933 17 6.992 373 0.019 2 *C2 16.730 933 64 1 16.730 93 125.367 3 <0.000 1 **D2 0.189 176 255 1 0.189 176 1.417 525 0.253 6殘差42.914 294 46 28

        2.2.2 響應(yīng)面試驗因素的相互影響 根據(jù)回歸模型方差分析(表3)可知,液料比和乙醇濃度的交互項對紫蘇葉總黃酮提取率影響顯著,將超聲時間和提取溫度中的兩個因素固定在零水平,得到液料比和乙醇濃度兩個因素對紫蘇葉總黃酮提取率交互影響的響應(yīng)曲面圖(圖2)。由圖2可知:液料比和乙醇濃度之間的等高線形狀呈橢圓形,響應(yīng)曲面坡度非常陡峭,說明AC之間的交互作用強,對紫蘇葉中總黃酮提取率的影響大,達到顯著水平(P<0.05)。

        2.2.3 最佳工藝參數(shù)及驗證實驗 進一步分析回歸方程,得到響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉中總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝條件為:液料比29.24∶1(V∶m)、超聲時間40.02min、乙醇濃度44.57%、提取溫度50.51℃,在此條件下總黃酮提取率的理論值為5.56%。為進一步驗證該模型的可靠性,根據(jù)實際可操作情況,采用修正的最佳提取工藝條件:液料比2 9∶1(V∶m)、超聲時間40min、乙醇濃度45%、提取溫度51℃,對超聲波輔助乙醇提取紫蘇葉中總黃酮工藝進行驗證性實驗(n=3),得到紫蘇葉中總黃酮實際提取率的平均值為5.41%,與理論預(yù)測值5.56%誤差在5%以內(nèi),說明該回歸模型可靠,具有一定的實用價值。

        圖2 液料比和乙醇濃度兩因素交互作用對紫蘇葉中總黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面圖Figure 2 Response surface plots and contour of liquidmaterial ratio and ethanol concentration interactive effects on the extraction rate of total flavonoids from Perilla frutescens leaves

        3 結(jié)論

        本研究通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計試驗,對超聲波輔助提取紫蘇葉中總黃酮的工藝進行優(yōu)化、修正和驗證,得到紫蘇葉中總黃酮提取的最佳工藝條件:液料比29∶1(V∶m)、超聲時間40min(超聲功率300W)、乙醇濃度45%、提取溫度51℃,在此條件下,總黃酮實際提取率達5.41%,說明試驗采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫蘇葉中總黃酮的提取具有實際可行性,為紫蘇葉的綜合開發(fā)利用,降低提取成本、減少能耗和工業(yè)化生產(chǎn)作業(yè)合理化提供有價值的參考依據(jù)。紫蘇葉中總黃酮的提取效果可能還與紫蘇葉的采收期、粉碎粒徑大小及采后存放環(huán)境等有關(guān),對此,還需深入研究。

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