孔鋮英 陳寶元 趙海燕

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院呼吸內(nèi)科 浙江義烏 322000;2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科 天津 300052)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是一種常見的睡眠呼吸疾病,表現(xiàn)為睡眠時(shí)反復(fù)發(fā)生上氣道塌陷導(dǎo)致呼吸暫停和呼吸低通氣,從而發(fā)生間歇性低氧血癥(IH),導(dǎo)致多系統(tǒng)、多器官損害［1］。目前認(rèn)為肥胖是OSAS的高危因素,且與OSAS合并代謝綜合征密切相關(guān)［1-2］。肝臟作為人體體內(nèi)的核心代謝器官,慢性間歇低氧血癥對(duì)其的影響有待進(jìn)一步研究。本研究研究建立不同頻率間歇低氧組普通飲食大鼠模型及抗氧化劑干預(yù)模型,探討OSAS模式CIH對(duì)大鼠肝臟組織損傷、肝糖原含量的影響及抗氧化劑Tempol的干預(yù)作用,從而為OSAS情況誘發(fā)肝臟損害、代謝紊亂的防治提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料

成年雄性Wistar大鼠80只[SCXK(京)2006—0009],體重(200±15)g。伊紅-美藍(lán)染液(天津北方天醫(yī)化學(xué)制品廠),糖原染色試劑盒(廣州市儷科貿(mào)易有限公司),4-Hydroxy-Tempol,純度>97%(美國(guó)SIGMA STBB3145)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制作及實(shí)驗(yàn)分組

48只大鼠均給予同種普通飼料喂養(yǎng),每天低氧實(shí)驗(yàn)時(shí)間為9:00—17:00,共42天。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡退出。建立間歇低氧模型[3]:通過(guò)計(jì)算機(jī)程控裝置控制低氧/復(fù)氧循環(huán),使暴露容器內(nèi)O2濃度在5%－21%間循環(huán),達(dá)到預(yù)置的低氧/復(fù)氧條件。采用隨機(jī)排列表法分組(每組8只):(1)間歇低氧組(IH):按照設(shè)定的5%間歇低氧模式循環(huán)充入N2和空氣,首先以10L/min充入N230秒,維持艙內(nèi)O2濃度至最低5%,隨后以10L/min充入壓縮空氣40秒,使艙內(nèi)O2濃度從低氧狀態(tài)恢復(fù)至正常(21%),維持以5L/min充人壓縮空氣維持常氧完成1個(gè)低氧周期。頻率為20、40次/小時(shí)。(2)Tempol干預(yù)組及生理鹽水干預(yù)組:選取預(yù)實(shí)驗(yàn)中肝組織病理改變最重40次/小時(shí)間歇低氧組進(jìn)行干預(yù),于暴露第28天干預(yù)至暴露結(jié)束,每天于暴露前15min,腹腔注射10%Tempol或生理鹽水,劑量為1ml/kg體重。(3)間歇正常氧組(IA):按照30次/小時(shí)頻率循環(huán)充人空氣,使艙內(nèi)O2濃度維持在21%。(4)空白對(duì)照組(CG):將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于普通飼養(yǎng)艙內(nèi)42天。

2.2 肝臟組織學(xué)及肝糖原含量觀察

暴露結(jié)束后各組大鼠均麻醉后股動(dòng)脈放血處死,迅速解剖取相同部位肝組織(0.5cm*0.5cm)置于10%中性甲醛中固定,經(jīng)過(guò)脫水、浸蠟、包埋、切片后,分別行HE和PAS染色,觀察肝臟組織學(xué)變化及肝糖原含量情況。

3 結(jié)果

(1)肝臟HE染色圖片見圖1。IA和IH組均未見肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積,無(wú)明顯炎癥或肝纖維化。IA組肝臟肝板排列有序,肝細(xì)胞胞膜完整,胞漿豐富,胞核形態(tài)正常,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)。20次/小時(shí)IH組肝臟組織學(xué)表現(xiàn)為肝臟肝板排列有序,肝血竇部分有增寬,細(xì)胞胞質(zhì)稀疏,肝細(xì)胞輕度腫脹,部分胞核深染、固縮,但未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞壞死(圖1B)。隨著IH的頻率增加,肝組織損傷有加重的趨勢(shì),40次/小時(shí)IH組可見明顯肝血竇增寬,胞漿深染,未見細(xì)胞腫脹,未見空泡,胞核深染固縮,時(shí)可見細(xì)胞局灶性壞死,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)。40次/小時(shí)IH組抗氧化劑Tempol干預(yù)組肝組織學(xué)表現(xiàn)為肝板排列有序,肝細(xì)胞胞膜完整,胞漿豐富,無(wú)細(xì)胞水腫或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。

(2)肝臟組織PSA染色圖片見圖2。IA肝組織含少量糖原(圖2A);20次/小時(shí)IH組肝組織肝糖原含量明顯增加(圖2B);40次/小時(shí)IH組肝細(xì)胞糖原貯積進(jìn)一步增加(圖2C);間歇低氧40次/小時(shí)暴露第28天抗氧化劑Tempol干預(yù)組肝糖原明顯減少(圖2D)。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)單純CIH可以引起Wistar大鼠肝臟損傷,且隨著頻率增加肝組織損傷加重,較高頻率可致肝血竇增寬,肝細(xì)胞局灶性壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但始終未見肝纖維化,SOD類似物Tempol抗氧化干預(yù)后肝組織損傷明顯減輕。結(jié)合我們之前的研究［4］,間歇低氧可致血清ALT、AST水平升高,且隨著頻率的增加肝酶水平進(jìn)一步升高,抗氧化劑Tempol干預(yù)肝酶水平下降,而且抗氧化劑干預(yù)越早肝損傷血清學(xué)表現(xiàn)越輕。關(guān)于CIH引起肝損傷的機(jī)制,我們之前的研究［5］發(fā)現(xiàn)各間歇低氧組肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物MDA水平升高,氧自由基清除劑SOD及總抗氧化能力T-AOC活性下降,證實(shí)IH大鼠模型中肝臟確實(shí)發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。綜上所述,我們可以認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷在OSAS模式CIH致肝損傷中起了重要作用,提示抗氧化劑可以O(shè)SAS患者肝損傷的情況。

圖1 肝組織HE染色×400倍。

圖2 肝臟PAS染色×400倍。

本研究還發(fā)現(xiàn)各間歇低氧組肝組織內(nèi)肝糖原含量明顯增加,這與Savransky等[6]研究一致。有學(xué)者曾報(bào)道1型糖尿病和血糖控制不理想的患者伴有肝臟糖原貯積[7－8],高血糖激活糖原磷酸化酶導(dǎo)致糖原合成增加[8]。我們研究中各間歇低氧組肝糖原含量明顯增加,提示長(zhǎng)期地間歇低氧導(dǎo)致大鼠體內(nèi)糖穩(wěn)態(tài)被破壞。

大鼠肝熱缺血模型研究[9]發(fā)現(xiàn),預(yù)防性地增加肝糖原貯備能拮抗熱缺血再灌注損傷過(guò)程中肝儲(chǔ)備功能的損害。Lavie et al認(rèn)為OSAS模式CIH的間歇性的低氧/復(fù)氧類似于缺血/再灌注事件[10],低氧／復(fù)氧過(guò)程中發(fā)生了氧化應(yīng)激。我們或許可以認(rèn)為慢性間歇低氧所致肝糖原貯備增加是機(jī)體對(duì)拮抗反復(fù)低氧／復(fù)氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激對(duì)肝儲(chǔ)備功能的損害。

慢性間歇低氧導(dǎo)致普通飲食大鼠肝臟糖原含量增加,而SOD類似物Tempol抗氧化干預(yù)可使大鼠肝臟糖原含量恢復(fù)正常水平。Polak J等在OSAS模式間歇低氧小鼠模型研究［11］中發(fā)現(xiàn)14天的間歇低氧暴露導(dǎo)致小鼠肝糖原貯備增加50倍,肝糖原含量與空腹血糖相關(guān)聯(lián),而且發(fā)現(xiàn)間歇低氧暴露下肝葡萄糖的輸出來(lái)自肝臟糖異生而非肝糖原分解,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖輸出增加的同時(shí)肝糖原貯備增加,解除間歇低氧暴露后小鼠肝糖原含量和空腹血糖水平可恢復(fù)正常,這與我們的研究吻合?？寡趸瘎┛寡趸委熆梢愿纳芆SAS患者糖代謝紊亂。

Tempol是一種小分子生物膜透過(guò)性的超氧化物歧化酶(SOD)類似物,能直接清除活性氧。本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化治療能改善OSAS模式間歇低氧所致的肝損傷及肝臟糖糖原累積,從而改善機(jī)體糖代謝紊亂。OSAS為全身性疾病,抗氧化治療能否改善多系統(tǒng)的損傷尚待進(jìn)一步研究。

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