曾葉 汪維成 鄭超

(浙江省醫(yī)療器械研究所 浙江杭州 310009)

1 前言

蛋白質(zhì)類藥物具有活性高、特異性強(qiáng)、低毒性、副作用小、生物功能明確、有利于臨床應(yīng)用等特點(diǎn)而倍受關(guān)注。但是其來源稀少、價(jià)格昂貴、藥效極高,由于容器壁的吸附而造成的濃度減小和波動(dòng)通常會(huì)給藥物的有效利用帶來麻煩[1,2]。實(shí)驗(yàn)和臨床都反復(fù)證實(shí),胰島素等蛋白類藥物在存儲(chǔ)和使用過程中因吸附于器壁的損失率可高達(dá)70%,這不僅造成醫(yī)療資源的極大浪費(fèi),還使得藥物療效大打折扣;再者,因器壁吸附而導(dǎo)致的藥物濃度波動(dòng)致使蛋白類藥物的用藥安全性受到很大的挑戰(zhàn),蛋白類藥物的高效性決定了其較小的有效濃度和較窄的有效濃度范圍,當(dāng)體內(nèi)血藥濃度超出有效濃度范圍時(shí)會(huì)產(chǎn)生諸多副作用,嚴(yán)重時(shí)將危及患者的生命[3,4]。因此,減少或者杜絕器壁對(duì)藥物的吸附是蛋白類藥物在使用過程中亟需解決的問題。

日本科學(xué)家淺川直樹等[5]嘗試了在胰島素溶液中加入不同濃度的卵磷脂等兩親性小分子,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在微量卵磷脂存在的情況下,胰島素在容器壁和輸送器壁上的吸附量都大大減少,回收率在90%以上,研究者們還發(fā)現(xiàn)這種卵磷脂等兩親性小分子加入法對(duì)親水性容器和疏水性容器有同樣的效果。但是加入的兩親性小分子會(huì)隨著藥液進(jìn)入人體,容易在體內(nèi)堆積,給患者帶來未知的風(fēng)險(xiǎn),使得這一方法并沒有很好地得到推廣。

國內(nèi)外專家通過在固體表面接枝磷酸膽堿(Phosphoryc holine),模擬磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)了類似細(xì)胞膜的非特異性高阻抗性能。不斷有報(bào)道證實(shí),磷酸膽堿修飾的固體表面能夠?qū)崿F(xiàn)抗凝血、抗蛋白吸附、抗細(xì)胞及細(xì)菌粘附等效果。目前,不少帶磷酸膽堿基團(tuán)的化合物已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。隨著研究的不斷深入,表面修飾用磷酸膽堿類化合物的種類不斷豐富,合成工藝不斷優(yōu)化,最常用的2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯(MPC)已經(jīng)商品化。

本研究通過將細(xì)胞膜仿生處理技術(shù)用于藥液存儲(chǔ)和輸送器皿的表面修飾上,在不向藥物溶液引入其它物質(zhì)的前提下,實(shí)現(xiàn)類似細(xì)胞膜表面的非特異性高阻抗效應(yīng),從根本上解決蛋白類藥物吸附損失的問題,杜絕由于藥物吸附而造成的藥物濃度波動(dòng),節(jié)省醫(yī)藥開支,增加用藥安全性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料

胰島素、2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯(MPC)、多巴胺鹽酸鹽(DOPA)、聚乙烯亞胺(PEI)購自sigmaaldrich,γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)和FITC購自阿拉丁試劑。

2.2 制備方法

圖2 聚丙烯表面氨基化處理后接觸角的變化:■空白;●APTS處理;▲ 分別是DOPA聚合不同時(shí)間后覆蓋pH為7、9、10的PEI。

圖3 FITC標(biāo)記后不同pH值PEI處理表面的紫外-可見吸收光譜

圖4 FITC標(biāo)記后不同聚合時(shí)間DOPA表面的紫外-可見吸收光譜

為制備細(xì)胞膜仿生的抗蛋白粘附表面,我們以聚丙烯板(PP)和玻璃片為基材,充分清洗之后,浸泡到多巴胺鹽酸鹽(DOPA)溶液中反應(yīng)一段時(shí)間,清洗吹干后浸泡到聚乙烯亞胺(PEI)溶液中一段時(shí)間,最后浸泡到2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基氨基)乙基磷酸酯(MPC)溶液中一段時(shí)間,洗凈吹干即可。

圖5 FITC標(biāo)記后不同處理方法表面的紫外-可見吸收光譜

圖6 PP基材上不同氨基化表面的xps圖譜

圖7 PP基材上N原子的百分比隨DOPA聚合時(shí)間延長的變化曲線

圖8 PP基材上不同氨基化處理表面N原子百分比

圖9 聚丙烯基材不同表面MPC固定化前后的接觸角變化

圖10 PP基材上氨基化表面固定MPC前后的xps圖譜

圖11 PP空白片吸附胰島素前后的xps圖譜

圖12 MPC固定化的PP片吸附胰島素前后的xps圖譜

3 結(jié)果與討論

本研究的工作內(nèi)容主要包括表面預(yù)處理、磷酸膽堿的表面固定化、表面蛋白吸附性能檢測(cè)這幾塊內(nèi)容。

3.1 基材的預(yù)處理

表面預(yù)處理的目的是使材料表面帶上氨基功能基團(tuán),以方便接枝帶有磷酸膽堿基團(tuán)的分子。高的表面氨基覆蓋率是成功制備細(xì)胞膜仿生表面的前提條件。這里我們首先使生物粘附分子DOPA在基材表面進(jìn)行聚合活化表面,隨后吸附一層PEI大分子,使得表面具有較高密度的氨基覆蓋率。圖1和圖2分布給出了玻璃和聚丙烯表面氨基化處理前后的接觸角數(shù)據(jù)。從圖1中可知,未處理的玻璃表面親水性很強(qiáng),接觸角接近0°,硅烷偶聯(lián)劑APTS處理之后,接觸角增加到了近30°;親水玻璃對(duì)PEI的吸附能力很強(qiáng),不同pH的PEI浸泡后接觸角也上升到30°左右,DOPA在玻璃表面聚合后再浸泡到PEI溶液中,表面的接觸角先增大后減小,最終穩(wěn)定在20-30°,表明表面氨基化的順利完成。（圖1、圖2）

從圖2可知,聚丙烯(PP)基材表面呈疏水性,接觸角高達(dá)100°,在硅烷偶聯(lián)劑APTS處理之后,接觸角并沒有改變,這是因?yàn)镻P表面沒有活性基團(tuán)可與硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng),致使APTS的氨基化反應(yīng)失敗;PEI分子在疏水的PP表面的吸附也不明顯,PP在不同pH的PEI溶液中浸泡后,接觸角并未見下降,而在DOPA聚合并進(jìn)行PEI浸泡后,表面接觸角迅速下降,最終穩(wěn)定在30°左右,表明在疏水的PP基材上表面氨基化的順利完成。

為進(jìn)一步驗(yàn)證表面氨基化的完成并考察氨基覆蓋程度,我們使用綠色熒光素(FITC)對(duì)氨基進(jìn)行標(biāo)記,隨后通過紫外-可見光譜對(duì)FITC進(jìn)行了表征。圖3-圖5給出的是不同氨基化處理表面FITC標(biāo)記后的紫外-可見光譜圖。如圖3所示,DOPA聚合2h時(shí),FITC標(biāo)記后500nm左右沒有明顯的吸收峰,證明DOPA聚合后表面并沒有氨基,繼續(xù)浸泡到PEI溶液中并經(jīng)FITC標(biāo)記后,500nm左右出現(xiàn)明顯的吸收峰,且隨著PEI溶液pH值的增加吸收峰值越大,表明PEI分子很容易吸附到DOPA聚合膜上,且吸附量隨著溶液pH值的增加而增加。

圖4跟蹤了不同聚合時(shí)間的DOPA膜表面吸附PEI后氨基的量,可見隨著DOPA聚合時(shí)間的延長,紫外-可見吸收光譜的基線升高,體現(xiàn)了DOPA聚合膜厚的增加,同時(shí)500nm左右的特征吸收峰值的增加也說明了隨著聚合時(shí)間的增加,吸附PEI的能力也逐漸增強(qiáng)并趨于飽和而穩(wěn)定。DOPA聚合膜上吸附PEI的量與PEI直接吸附于玻璃片上的量相當(dāng),且此時(shí)基材表面氨基的量小于APTS處理后的氨基量(圖5)。

結(jié)合接觸角與紫外-可見光譜數(shù)據(jù)可知,對(duì)玻璃表面進(jìn)行氨基化處理的最佳方式是硅烷偶聯(lián)劑APTS,同時(shí)通過DOPA聚合然后吸附PEI的方式也可以實(shí)現(xiàn)表面氨基化。

對(duì)于疏水的PP表面,我們通過xps對(duì)不同處理方式的氨基化表面進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證(圖6-圖8)。由圖6可知,PP在經(jīng)過硅烷偶聯(lián)劑APTS處理后,基本沒有變化,這與接觸角的數(shù)據(jù)一致,再次證實(shí)硅烷偶聯(lián)劑處理的方法不適用于PP這類惰性表面;PEI浸泡后N1s的位置有微弱的小峰,表明有極少量的PEI吸附到PP表面上;DOPA聚合后,N峰明顯增強(qiáng);DOPA聚合膜上吸附PEI后N峰進(jìn)一步增強(qiáng),證實(shí)DOPA可以成功在惰性的PP表面進(jìn)行聚合,并介導(dǎo)PEI的吸附。

圖7給出了隨著DOPA聚合時(shí)間的增加,N原子百分?jǐn)?shù)的變化情況,可見隨著聚合時(shí)間的增加,N原子在表面原子中所占的比例也大大增加,體現(xiàn)了DOPA表面聚合的順利進(jìn)行。

圖8給出的是PP基材上DOPA聚合24h后浸泡到不同pH值的PEI溶液中吸附PEI分子后表面N原子的百分比?？梢?隨著浸泡的PEI溶液的pH值的增加,N原子百分含量增加,表面PEI溶液pH的升高有助于表面吸附更大量的PEI分子。這一現(xiàn)象跟玻璃基材上的情況一致。

結(jié)合接觸角和xps數(shù)據(jù)證實(shí):雖然APTS處理和直接吸附PEI的方法不能有效作用于PP這類疏水的惰性表面,但是DOPA可以成功在改表面聚合,并能夠順利介導(dǎo)PEI的吸附,從而實(shí)現(xiàn)表面氨基化。

3.2 磷酸膽堿的表面固定化

經(jīng)過預(yù)處理的,表面帶有氨基功能基團(tuán)的基底材料,其表面的氨基能與MPC分子反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)表面MPC的固定化。我們首先用接觸角對(duì)基材表面的MPC固定化進(jìn)行了跟蹤,如圖9所示,直接吸附PEI的表面在浸泡到MPC溶液中之后其接觸角仍保持在90-100°之間,這一接觸角與PP基材的接觸角很接近,表明MPC不能順利接到該表面上;DOPA聚合2、5h后的表面在MPC固定化前后接觸角也沒有變化,而在DOPA聚合16、24h的表面上經(jīng)MPC固定化之后,接觸角上升到50-60°之間。

XPS用來進(jìn)一步驗(yàn)證MPC在材料表面的固定化情況,從圖10中可以看出,PEI直接吸附的PP表面在浸泡到MPC溶液中后,無論是N還是P的峰位都沒有明顯的吸收;而在DOPA介導(dǎo)的PEI吸附表面上,在固定了MPC之后,在P的峰位出現(xiàn)了明顯的吸收峰,證實(shí)了MPC成功地接枝到了基材表面。且不同DOPA聚合時(shí)間介導(dǎo)的PEI吸附表面都能夠固定MPC。

3.3 基材表面蛋白吸附性能檢測(cè)

為考查基材表面細(xì)胞膜仿生修飾的有效性,我們以胰島素為模型蛋白,通過xps檢測(cè)基材在與胰島素溶液接觸前后表面化學(xué)組成的變化。

圖11和圖12分別展示了空白PP和經(jīng)DOPA介導(dǎo)PEI吸附并固定MPC后的PP片上胰島素的吸附情況。從圖11上可以明顯看到,在浸泡到胰島素溶液中之后,PP表面出現(xiàn)了N吸收峰,且O的吸收峰形發(fā)生變化同時(shí)吸收值大大增加,這些現(xiàn)象均證實(shí)了胰島素在PP表面的吸附。

圖12顯示的是經(jīng)DOPA介導(dǎo)吸附了PEI并且固定了MPC表面在浸泡到MPC溶液中前后的xps圖譜,可見該表面在浸泡到胰島素溶液前后沒有明顯的變化,證實(shí)了該表面良好的抗蛋白(胰島素)粘附性能。

4 全文結(jié)論

本文通過DOPA表面聚合介導(dǎo)PEI分子在疏水惰性表面的吸附,并進(jìn)一步固定MPC,成功地在聚丙烯及玻璃基材上制備了細(xì)胞膜仿生的磷酸膽堿兩性分子表面,接觸角、紫外-可見吸收光譜、xps證實(shí)了這一過程的順利進(jìn)行;xps數(shù)據(jù)還進(jìn)一步證實(shí)該表面能夠有效阻抗胰島素的粘附。

[1]侯惠如,孟曉敏,吳素芬,等.輸液裝置對(duì)胰島素吸附作用的研究[J].中華護(hù)理雜志,1999,34(11):649.

[2]王忍.藥物在輸液管中的損失[J].中國藥房,1992,3(4):40.

[3]龐英杰,陳晰敏,糖尿病病人靜脈用藥后低血糖反應(yīng)的分析與對(duì)策[J].護(hù)理研究雜志,2007(S0):98.

[4]柴曉媛,龐英杰,陳淑敏,等.振搖法預(yù)防臨床輸注胰島素突發(fā)低血糖反應(yīng)的研究[J].中國實(shí)用護(hù)理雜志,2008,24(9):52.

[5]淺川直樹.防止容器對(duì)胰島素的吸附作用[J].藥學(xué)雜志,1984,104(3):311.