吳滿剛，吳雪燕，于海，葛慶豐，汪志君

(揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州，225127)

中式香腸是我國傳統(tǒng)風干香腸的主要代表，因風味獨特、保質期長等優(yōu)點使其受到人們的廣泛喜愛，它由瘦肉，脂肪，鹽，香料，添加劑(硝酸鹽、亞硝酸鹽和抗氧化劑)以及發(fā)酵劑(選擇性加入)混合加工而成［1］。肉制品加工過程中，蛋白質表現(xiàn)出一系列功能性質，如凝膠性使得產(chǎn)品經(jīng)加熱形成網(wǎng)狀結構，其中各個組分相互作用表現(xiàn)出不同感官品質;在中式香腸風干過程中，內在因素(金屬離子、脂肪組成)和外在因素(氧氣、溫度、光照)都會促使其蛋白氧化，造成蛋白溶解性、乳化性、降解性等功能性質的改變［2］，進而影響產(chǎn)品品質。因此，在加工過程中蛋白質成分和功能性質的變化對肉制品的結構、感官和營養(yǎng)品質具有重要影響［3］。

蛋白氧化修飾主要包括蛋白變性(功能結構損失)以及在外源酶和/或內源酶下水解降解(蛋白酶水解)。肉制品加工過程中蛋白質降解作用對產(chǎn)品質構、口感或風味的形成有重要意義［4］:脂類分解是干熏肉制品加工過程中最重要的生化變化之一，脂類易被脂酶水解成游離脂肪酸。伴隨游離脂肪酸的釋放，脂肪酸的次級反應會生成自由基［5］。在肉加工過程中(切碎、腌漬、烹飪、輻照等)，來自脂類分解的氧自由基的累積易造成蛋白氧化損傷［6］，而蛋白氧化誘導多種氨基酸發(fā)生修飾，形成羰基衍生物［7］。蛋白氧化導致硫醇基和酪氨酸含量下降，分別形成二硫鍵和二酪氨酸，在模擬實驗中二硫鍵和二酪氨酸的形成與蛋白功能改變有關［8］。在生物醫(yī)學研究中，蛋白氧化和蛋白水解之間的相互作用已被廣泛研究。例如，增加表面疏水性有利于蛋白酶降解蛋白質，然而蛋白質在高度氧化情況下內部分子發(fā)生交聯(lián)作用形成聚合物導致其對蛋白酶敏感性降低［9］。已有研究報道過肉制品中氨基酸氧化，蛋白質聚集以及蛋白氧化和蛋白水解的相互關系［10-11］，但總體而言，關于肉制品加工過程中蛋白質氧化變化對中式香腸蛋白質性質影響的相關研究還比較少。

本文以中式香腸為研究對象，提取香腸中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，跟蹤監(jiān)測分析蛋白在香腸風干過程中氧化指標，并結合分析蛋白溶液渾濁度、蛋白SDS-PAGE電泳圖及蛋白溶解性，以期明確蛋白氧化在香腸風干過程中與蛋白聚集、蛋白水解和蛋白結構之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬里脊肉、豬背肥膘、腸衣、配料等;5，5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、2，4-二硝基苯肼、碘化汞、茚三酮，均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 中式香腸的制作

里脊肉與豬肥膘按照質量4∶1比例混合，每100 g肉中加入白糖7 g，食鹽3 g，大曲2 mL，生姜0.15 g，味精 0.2 g，五香粉 0.1 g，水 10 g。

原料肉→漂洗→斬拌(肥、瘦肉切成8～10 mm大小的肉粒)→配料→灌腸(單根腸長度18～20 cm，直徑4.2～4.5 cm，灌注原料肉110 g)→結扎→晾掛自然風干(15℃，10 d)→成品

香腸灌制結束后風干過程中分別在0、5、10、15、20、25、30 d 取樣，測定各項指標。

1.2.2 蛋白提取方法

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取方法參照文獻［12］。

1.2.3 蛋白氧化指標的測定

羰基含量的測定參考文獻［13］，游離硫醇基含量的測定參考文獻［14］。

1.2.4 濁度測定

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液稀釋到2 mg/mL在室溫(25℃)放置20 min后，測其340 nm吸光度(A340)［15］。

1.2.5 蛋白質表面疏水性

1.2.5.1 肌漿蛋白的表面疏水性

參照 Cardamone［16］的方法，并作改進。采用 1-苯胺基-8-萘磺酸［1-(aniline)naphthalene-8-sulfonate，ANS］熒光探針法測定肌漿蛋白的表面疏水性。采用10 mmol/L，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液將肌漿蛋白溶液稀釋至濃度分別為 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/mL的稀蛋白溶液。4mL蛋白溶液加上20 μL 8 mm ANS溶液，混合5 s，靜置3 min。設定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫校正均為5 nm。以熒光強度對蛋白質的濃度做曲線，曲線初始階段的斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.2.5.2 肌原纖維蛋白的表面疏水性

參照 Martinaud［17］和 Chelh［18］方法，取 10g 香腸，剔除可見脂肪，加入100 mL pH 6.5的緩沖液(150 mmol/L NaCl，25 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，4 mmol/L EDTA和1 mmol/L PMSF)，冰浴中勻漿30s，混合液過60目篩以去除基質蛋白。濾液10 000×g離心15 min。沉淀用100 mL pH 6.4的50 mmol/L KCl溶液洗滌2次，再用100 mL pH 6.0的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌1次。沉淀用pH 6.0的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解，蛋白濃度調成5 mg/mL。

1 mL蛋白懸浮液中加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液，均勻混合。對照為1 mL的20 mm(pH 6.0)磷酸緩沖液加入300 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液。樣品和對照在溫室下持續(xù)攪拌10 min，在離心機中2 000×g離心5 min。上清液稀釋10倍，以磷酸鹽做空白，在595 nm下測定吸光值。表面疏水性的計算公式:

1.2.6 SDS-PAGE方法檢測蛋白水解變化

參照郭君堯［19］的方法對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白進行SDS-PAGE分析。蛋白與樣品緩沖溶液按體積比1∶1混合，100℃水浴加熱5 min。選取12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時初始電流為10 mA，當樣品前沿剛好進入分離膠后將電壓提高到20 mA，電泳時間約2 h。

染色:加入考馬斯亮藍R-250染色液(V甲醇∶V冰醋酸∶V水=45∶10∶45，并加入0.2%考馬斯亮藍R-250)，混合染色40 min。

脫色:用清水清洗凝膠，加脫色液(V甲醇∶V冰醋酸∶V水=5∶5∶40)，于脫色搖床上反復多次脫色。

1.2.7 蛋白溶解性研究

香腸蛋白溶解性的測定方法參照Roussel［20］的方法，略作修改。溶解液包括:(S1)0.06 mol/L KCl;(S2)20 mmol/L Tris，pH 8.0;(S3)20 mmol/L Tris，pH 8.0 包含10 g/L SDS;(S4)20 mmol/L Tris，pH 8.0包含10 g/L SDS和8 mol/L尿素;(S5)20 mmol/L Tris，pH 8.0包含10 g/L SDS，8 mol/L 尿素和體積分數(shù)2%β-巰基乙醇;(S6)0.5 mol/L NaOH。取2g香腸，分別加入20 mL以上試劑中，室溫中磁力攪拌4h。S5在攪拌前100℃水浴中加熱2 min。所有樣品在12 100×g下離心30 min。取4mL上清液加入0.5 g/mL TCA(最終濃度為10%)。樣品在3℃下靜置18 h，2 500×g下離心20 min。沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液溶解，雙縮脲方法測定蛋白含量，牛血清白蛋白BSA為標準樣品。溶解性結果用各部分蛋白占S6的百分比表示。

2 分析與結果

2.1 成熟過程中蛋白羰基含量的的變化

風干過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中羰基含量變化如圖1所示。

肌原纖維蛋白的羰基值明顯高于肌漿蛋白。肌漿蛋白羰基含量呈緩慢上升趨勢，風干結束時達到5.03 nmol/mg蛋白。前15d肌原纖維蛋白羰基值含量呈上升趨勢，15d后開始下降，分析其原因可能是蛋白質羰基會發(fā)生進一步的反應，例如蛋白質羰基氧化成酸類物質，羰基分子之間形成醇醛縮合物，蛋白質羰基與氨基酸之間形成甲亞胺等［21］。

圖1 風干過程中香腸肌漿蛋白和肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig.1 Changes in the carbonyl content of sarcoplacmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

蛋白羰基是蛋白氧化的主要產(chǎn)物，主要通過以下4個途徑形成:(1)賴氨酸，蘇氨酸，精氨酸和脯氨酸側鏈的直接氧化;(2)在還原糖的作用下發(fā)生非酶糖化反應;(3)通過α-酰胺化途徑或在谷?；鶄孺溠趸闆r下多肽鏈的氧化斷裂;(4)與非蛋白羰基如4-羥基-2-壬醛(HNE)或丙二醛(MDA)共價結合［21］。蛋白氧化會導致蛋白質發(fā)生聚集。賴氨酸的游離NH2與脂肪氧化的產(chǎn)物醛類物質的相互作用形成席夫堿，從而誘導蛋白聚集［22］。此外，蛋白氧化也會改變蛋白質的二級和三級結構，進而使蛋白物理性質發(fā)生改變，如蛋白表面疏水性升高和蛋白溶解性降低［11］。

2.2 成熟過程中巰基含量的變化

香腸蛋白氧化敏感性也可通過游離硫醇基含量變化體現(xiàn)出來，結果如圖2所示。在香腸風干過程中，肌漿蛋白中巰基含量顯著高于肌原纖維蛋白中巰基含量。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白巰基含量整體呈下降趨勢，分別從113.2和57.5 μmol/mg蛋白下降到53.54和42.22 μmol/mg蛋白。硫醇基含量降低主要是由于蛋白表面的半胱氨酸中的游離硫醇基發(fā)生氧化，形成了二硫鍵。

圖2 風干過程中香腸肌漿蛋白和肌原纖維蛋白巰基含量的變化Fig.2 Changes of S-H group levels of sarcoplacmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

在食物的加工過程中，加熱、機械剪切力和暴露在空氣或油-水界面等條件都會改變蛋白的三級結構。這些外在因素能引發(fā)巰基和胱氨酸與水接觸，經(jīng)化學反應形成二硫鍵。魚肉醬、香腸和酸奶等食物的形成中，二硫鍵對獲得良好的蛋白質功能起重要作用［23］。這種現(xiàn)象可能對香腸中蛋白-蛋白之間的相互作用和聚集物的形成有重要影響。

2.3 香腸風干過程中濁度變化

濁度可以反映蛋白質的聚集程度。溶液中蛋白質聚集形成顆粒的數(shù)目越多、體積越大，濁度就越大［24］。如圖3所示，隨著時間的延長，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的渾濁度在呈上升趨勢，說明了香腸成熟期間蛋白聚集物逐漸增多。

圖3 風干過程中香腸肌漿和肌原纖維蛋白濁度的變化趨勢Fig.3 Changes ofturbidity sarcoplacmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液濃度在相同的情況下，肌原纖維蛋白的濁度比肌漿濁度大，說明肌原纖維蛋白更易氧化聚集。蛋白渾濁度的上升表明香腸在風干過程中蛋白空間結構發(fā)生變化，疏水基團暴露，暴露的疏水基團使蛋白聚集。

2.4 香腸風干過程中蛋白水解情況

肌漿蛋白的分子質量范圍是14～150 kDa，其特征條帶有磷酸化酶(150 kDa)，肌酸激酶(100 kDa)，磷酸甘油酸酯變位酶(45 kDa)，磷酸甘油酸酯激酶(35 kDa)，磷酸丙糖異構酶(20 kDa)。在蛋白質水解作用或者酸、鹽誘導的“變性”情況下，這些蛋白含量可能會減少。從第10天開始，分子質量為150 kDa左右的蛋白條帶發(fā)生大量降解形成更多小分子片段。

肌原纖維蛋白的特征條帶有肌球蛋白重鏈(MHC，200 kDa)，α-輔助肌動蛋白(94 kDa)，原肌球蛋白(80 kDa)，肌鈣蛋白(75 kDa)，肌動蛋白(45 kDa)和肌球輕鏈(20 kDa)。肌原纖維蛋白與肉制品緊密結合的結構及穩(wěn)固的質地有關，所以其對肉制品加工起著至關重要的作用。MHC和肌動蛋白條帶隨著時間的延長逐漸變淺，30 kDa和25 kDa處的蛋白發(fā)生降解，同時α-輔助肌動蛋白條帶也發(fā)生降解。

圖4 肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretograms of sarcoplacmic proteins

圖5 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoretograms of myofibrillar proteins

香腸風干期間，肌肉細胞壁或細胞膜上的肽鏈內切酶(鈣蛋白酶Ⅰ，Ⅱ和組織蛋白酶B，D，H，L)和微生物蛋白酶促進了蛋白降解的發(fā)生［25］。在低水平氧化情況下，蛋白結構的微小改變有利于蛋白酶水解位點的識別，蛋白水解性增強。在高氧化水平情況下，蛋白聚合物的形成以及特殊氨基酸側鏈的氧化都會改變識別位點，因此蛋白水解性降低［11］。不同時間段蛋白水解率的差異可能與氧化程度有關。以上變化表明中式香腸蛋白在成熟期間發(fā)生氧化降解。

2.5 風干過程中蛋白表面疏水性變化

香腸風干過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性變化情況如圖6所示。肌漿蛋白是一種水溶性蛋白，采用ANS熒光探針法測定其表面疏水性。風干前20 d肌漿蛋白表面疏水性呈上升趨勢，第20天時達到最大值，25 d開始呈下降趨勢。肌原纖維蛋白是一種鹽溶性蛋白，采用疏水性基團與溴酚藍結合的方法測定其表面疏水性。前25 d肌原纖維蛋白的疏水性呈升高趨勢，25 d后有所下降。

圖6 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins and myofibrillar proteins during drying of Chinese-style Sausage

疏水作用力是維持蛋白質三級結構最重要的作用力。蛋白質的疏水性能反映出蛋白質化學和物理性質的微小變化，是評價蛋白變性的一個重要參數(shù)。大量研究表明蛋白疏水性和蛋白氧化有關，氧化會使蛋白結構內部的疏水氨基酸暴露出來，從而增加蛋白的表面疏水性［19］。以上結果表明香腸蛋白在風干過程中發(fā)生氧化，蛋白內部疏水基團暴露出來導致表面疏水性增加。另有研究表明蛋白質在酶作用下降解，也會使蛋白內部疏水基團暴露出來［23，26］。

2.6 香腸風干過程中蛋白溶解性變化情況

香腸風干過程中蛋白溶解性變化情況如圖7所示。隨著風干時間的延長，蛋白質在溶液S1和S2中的溶解度呈降低趨勢，分別從36.62%到18.97%和從43.67%降低到24.54%，分析其原因可能是香腸在風干過程中蛋白質發(fā)生變性或降解導致蛋白質損失。香腸風干過程中蛋白在溶劑S3和S4呈增長趨勢表明氫鍵和疏水作用力是穩(wěn)定香腸蛋白質的重要作用力。相比之下，含有2%的β-巰基乙醇的溶劑(S5)具有更高的溶解度，這表明二硫鍵對增強香腸蛋白結構具有非常重要的作用。

蛋白質與溶劑之間有相互作用力，包括氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用。本研究采用5種不同的溶劑規(guī)避不同的蛋白質相互作用力，利用KCl規(guī)避靜電相互作用力，SDS規(guī)避氫鍵，尿素規(guī)避疏水相互作用力，巰基乙醇打斷二硫鍵，分別考察上述不同分子作用力對中式香腸蛋白質三維結構的貢獻［3］。此研究結果表明氫鍵、疏水作用力和二硫鍵對蛋白質結構的形成和穩(wěn)定具有重要意義。

3 結論

圖7 香腸風干期蛋白溶解度變化Fig.7 Changes in solubility of Chinese-style sausage during drying of Chinese-style Sausage

中式香腸風干過程中，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白羰基值呈上升趨勢，且游離硫醇基值的流失，說明香腸蛋白在風干過程中蛋白發(fā)生了氧化。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的濁度和表面疏水性上升趨勢表明蛋白氧化會導致蛋白質結構發(fā)生改變，蛋白內部疏水基團易暴露出來導致表面疏水性增加，蛋白溶解度下降導致蛋白聚集程度增加，但蛋白氧化對蛋白的二級結構(如α-螺旋，β-折疊含量)的影響有待進一步研究。SDS-PAGE電泳圖顯示蛋白氧化導致蛋白發(fā)生不同程度的降解，但確定電泳圖中具體蛋白條帶的氧化還需要結合蛋白免疫印跡實驗進行分析。中式香腸蛋白質相互作用力在加工過程中顯著變化，隨著蛋白氧化的進行，風干后期穩(wěn)定中式香腸蛋白質的作用力主要有氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵。

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