蘇悟，鄭小芬，徐睿烜，涂婷，蔣立文

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410128)

2(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙，410128)

3(湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

豆豉是經(jīng)微生物發(fā)酵制成的調(diào)味副食品，以香誘人、風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者的真愛。根據(jù)制曲發(fā)時(shí)參與的微生物種類可分為毛霉型、曲霉型、細(xì)菌型及脈胞菌型豆豉［1］。水豆豉主要是云、貴、山東一帶民間制作的家常豉，其微生物主要是枯草桿菌以及少量的微球菌乳酸菌，其工藝簡(jiǎn)單，就是將黃豆蒸熟后直接裝在袋子或者攤放在稻草上自然發(fā)酵，發(fā)酵完成后直接拌食。水豆豉自然發(fā)酵過程中微生物以細(xì)菌為主，發(fā)酵過程中易產(chǎn)生生物胺。生物胺是一類含氮低分子質(zhì)量化合物的總稱，按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺)、芳香族(酪胺、苯基乙胺)和雜環(huán)類(組胺、色胺)［3］。人體內(nèi)積累較高數(shù)量的生物胺時(shí)就會(huì)產(chǎn)生毒性作用，其中生物胺中毒性最大的是組胺和酪胺［4］。

發(fā)酵食品中過量的生物胺會(huì)對(duì)機(jī)體健康造成不良的影響。YONGMEIL等［5］檢測(cè)了中國(guó)豆醬中的生物胺含量，豆醬中主要含有酪胺、組胺和亞精胺，不同發(fā)酵類型品種生物胺有差別，生物胺生成量與樣品中氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)正相關(guān)，由此可以看出，可利用的游離氨基酸是微生物代謝產(chǎn)生生物胺的必要條件之一。張建華等［6］檢測(cè)了納豆發(fā)酵過程中的生物胺，在發(fā)酵納豆樣品中檢測(cè)到亞精胺、精胺、腐胺、酪胺4種生物胺，其中亞精胺的含量占總生物胺的70%左右，與人體有直接毒性的生物胺—酪胺含量低于14 mg/kg，95%以上的生物胺都是對(duì)人體沒有直接毒性的多聚胺。TANG T等［7］檢測(cè)了腐乳中生物胺的含量，同時(shí)比較了微生物發(fā)酵腐乳與酶制腐乳中生物胺含量的差別。腐乳中主要含有色胺、腐胺、組胺和酪胺，其平均含量分別為39.0、34.6、18.2、21.7 mg/kg，β-苯乙胺、亞精胺和精胺含量較低。微生物發(fā)酵腐乳中生物胺總量(129.0 mg/kg)低于酶制腐乳(137.7 mg/kg)，腐乳中生物胺總量低于安全限量。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于毛霉型、曲霉型豆豉和以納豆為代表的細(xì)菌型豆豉的營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵工藝都進(jìn)行了較深入的研究［8-10］，但國(guó)內(nèi)對(duì)自然發(fā)酵過程中生物胺的變化研究甚少。且目前國(guó)際上對(duì)食品中的生物胺沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，少數(shù)國(guó)家也只對(duì)于食品中的部分生物胺作出了含量限定，現(xiàn)有的各項(xiàng)法規(guī)都只對(duì)魚類及其制品中的組胺進(jìn)行了限定，因此對(duì)于食品中生物胺毒性和檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)研究，和生物胺限量標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確評(píng)估工作都是具有實(shí)際意義的。農(nóng)村中，許多農(nóng)戶都是將黃豆在自然條件下發(fā)酵，直接拌料進(jìn)行食用，本文以普通黃豆為原料，研究一定溫度、一定裝載量、不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中生物胺及氨基酸態(tài)氮2個(gè)指標(biāo)的影響及其相關(guān)性，為食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 原料

黃豆、生姜、大蒜、桂皮、八角購(gòu)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生鮮市場(chǎng)。

1.1.2 試劑

NaOH，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;鄰苯二甲酸氫鉀，湖南省株洲市化學(xué)工業(yè)研究所;甲醛，上?；瘜W(xué)試劑廠;組胺鹽酸鹽(himstaminedihydrochloride)、β-苯乙胺(β-phenylethylamine)、酪胺鹽酸鹽(tyramine hydrochloride)、腐胺(putrescine)、尸胺(cadaverine)、5-羥色胺(serotonin)、精胺(spermidine)、亞精胺(spermine)、色胺鹽酸鹽(tryptaminehydmchloride)，Aldrich 公司;l，7 二氨基庚烷(1，7-diaminoheptane，內(nèi)標(biāo))，Acros公司;苯甲胺鹽酸鹽(benzylamine hydrochloride，內(nèi)標(biāo))、丹磺酰氯(dansylchloride)，Sigma公司;甲醇、丙酮，色譜純;乙醚(重蒸)、正丁醇、氯仿、HCl、三氯乙酸(TCA)、NaCl、NaHCO3、谷氨酸鈉(分析純)、超純水。

1.2 主要儀器設(shè)備

TE212-L電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理化學(xué)儀器廠;pHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)，中國(guó)雷磁儀器有限公司;HJ-1磁力加熱攪拌器，江蘇醫(yī)療儀器廠;DGG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)，上海浦東物理化學(xué)儀器廠;高效液相色譜儀HPLC配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器;離心機(jī)(4 000 r/min)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;旋渦混合器 ortex-2genie USA，seinetitic industries，INC，USA;氮?dú)鉂饪s器(N-EVAPORATOR)，OrganomationassociatesINC.USA;Waters高效液相色譜儀e2695配2489紫外檢測(cè)器，美國(guó)沃特斯有限公司;色譜柱 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，GL Sciences;超純水器B110-B，長(zhǎng)沙源科儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司;微型旋渦混合儀WH-2，上海瀘西分析儀器廠有限公司;臺(tái)式低速離心機(jī)TG16，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;多用調(diào)速振蕩器 HY-4，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;氮?dú)獯祾邇xMD200，杭州奧盛儀器有限公司;電子分析天平AR2140，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;生化培養(yǎng)箱LRH-300，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌型水豆豉制作工藝流程

黃豆→清選→加水浸泡→蒸煮(高壓121℃、15 min)→冷卻→前發(fā)酵(37℃、不同時(shí)間)→直接拌料→成品。

1.3.2 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

以下操作均為一致的黃豆浸泡條件:泡豆水pH 8.0，泡豆溫度常溫，豆量∶水量為1∶4(g∶mL)，泡豆時(shí)間10 h。高壓121℃、15 min蒸熟，降溫到45℃后，用1 kg的食品級(jí)包裝袋包裝發(fā)酵，平整后在包裝袋表面扎數(shù)個(gè)小孔，裝豆量800 g，發(fā)酵時(shí)間72～120 h，發(fā)酵溫度為37℃，稱取發(fā)酵樣品，按48、72、96、120 h不同發(fā)酵時(shí)間，測(cè)定氨基酸態(tài)氮和生物胺含量，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定［11］

1.4.2 生物胺含量的測(cè)定［12］

1.4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

各生物胺標(biāo)準(zhǔn)品用0.1 mol/L HCl溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液(酪胺鹽酸鹽和二鹽酸組胺需折算掉鹽酸鹽)，分別吸取相同體積的8種生物胺單組分置于同一個(gè)容量瓶中，配制成100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。所有溶液均避光保存于4℃冰箱中。

將混合使用液配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度為:2.50，5.00，10.00，15.00，25.00，50.00 mg/L。分別吸取0.5 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行生物胺衍生化。為確定生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序，配制成40 mg/L的8種單一生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，可由生物胺標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的保留時(shí)間來確定每種生物胺。

1.4.2.2 生物胺的提取和衍生

生物胺的提取和衍生依據(jù)《GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測(cè)定》。準(zhǔn)確稱取絞碎后的豆豉樣品10.00 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，和2.0 mL(100 mg/L)內(nèi)標(biāo)使用液，混勻，振蕩提取60 min，轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，3 600 r/min離心10 min，取上清液，置50 mL容量瓶中，連續(xù)提取2次，合并上清液，用5%三氯乙酸稀釋至刻度，濾紙過濾。

將上述溶液加入適量HaCl至飽和，準(zhǔn)確移取該飽和液5.00 mL，置于15 mL離心管中，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12.0，加入5.0 mL正丁醇-三氯甲烷混合液(1+1)，渦旋振蕩5 min，3 600 r/min離心10 min，取上層有機(jī)相，再重復(fù)萃取2次，最后一步萃取用分液漏斗分離，合并萃取液，混勻，取3.0 mL萃取液并加入0.2 mL 1 mol/L HCl，混合后40℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL 1mol/L HCl使殘留物溶解，待衍生。

取經(jīng)過提取，凈化、萃取后的樣液0.5 mL，置于10 mL具塞試管中，加入1.5 mL NaHCO3飽和溶液、1.0 m丹磺酰氯衍生溶液，振蕩使混勻。置60℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，中間振蕩2次，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉(50 mg/mL飽和 NaHCO3溶液)，振蕩混勻，60℃中保溫15 min。取出，每個(gè)試管中加入1 mL超純水，40℃水浴下用氮?dú)獬鋈ケ?。加? mL乙醚，振蕩2 min，靜置分層后吸取出上層有機(jī)相(乙醚層)，重復(fù)萃取2次，合并乙醚萃取液，氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL甲醇使殘留物溶解，振蕩混勻，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，濾液待測(cè)。

樣品衍生后，依據(jù)《GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測(cè)定》上機(jī)測(cè)定。為了使各種生物胺的保留時(shí)間縮短，而響應(yīng)值高，分離度高，改變了色譜條件:將1.5 mL/min流速改為1.0 mL/min，梯度洗脫程序更改情況如表1所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program list

1.4.2.3 精密度的測(cè)定

取濃度為25.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生樣品，平行進(jìn)樣7次，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.4.3 對(duì)照樣品分析

樣品來源:購(gòu)買3個(gè)不同品牌商品發(fā)酵豆豉測(cè)定其中8種生物胺的含量。

生物胺的提取:樣品經(jīng)研磨充分后，取樣，用三氯乙酸提取，將試樣除脂肪、萃取進(jìn)行凈化，然后進(jìn)行生物胺的衍生反應(yīng)，樣液待測(cè)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)利用Excel表格進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際樣品圖譜

40 mg/L單一生物胺衍生物的色譜圖如圖1、圖2所示。

更改了流速和梯度洗脫程序后，濃度為50 mg/L 8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液混標(biāo)的色譜圖如圖3所示。

圖1 β-苯乙胺衍生物色譜圖Fig.1 Beta phenethylamine derivative chromatogram

圖2 酪胺衍生物色譜圖Fig.2 Tyramine derivative chromatogram

圖3 8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.3 Standard chromatogram of eight kinds of biogenic amine

從圖3可以看出，相較國(guó)標(biāo)方法30min所有生物胺衍生物全部洗脫出來，整個(gè)梯度洗脫結(jié)束為45 min，更改流速和調(diào)整洗脫程序后28 min內(nèi)所有生物胺衍生物被全部洗脫出來，洗脫程序結(jié)束時(shí)間為32 min，提前了13 min，節(jié)省了樣品分析時(shí)間，在實(shí)際檢驗(yàn)分析工作中有很重要的意義，且各生物胺衍生物分離效果好，峰形對(duì)稱，無雜質(zhì)干擾，因此該流動(dòng)相梯度是可行的。8種單一生物胺衍生物分析結(jié)束后，確定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液8種生物胺衍生物的出峰順序?yàn)?組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、亞精胺、精胺。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證

以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量(μg)為縱坐標(biāo)，以各種生物胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8種生物胺的保留時(shí)間、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 8種生物胺的保留時(shí)間、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Retention time，the regression equation and correlation coefficient of 8 kinds of biogenic amine

檢測(cè)方法的驗(yàn)證結(jié)果見表2。由表2可以看出，8種生物胺的含量在2.5～50 mg/L時(shí)，其回歸方程R2大于等于0.992 8，可以滿足生物胺檢測(cè)的需求。

2.3 精密度

8種生物胺精度度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 precision test results

2.4 前發(fā)酵過程中生物胺的變化

表4 生物胺含量測(cè)定結(jié)果(37℃)Table 4 Biogenic amine content determination results

上表為最適發(fā)酵條件下，選取不同時(shí)間梯度對(duì)豆豉中生物胺含量的測(cè)定結(jié)果，從發(fā)酵豆豉中共檢測(cè)到8種生物胺。所有樣品中均含有β-苯乙胺含量、尸胺、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺。不同樣品中生物胺種類及總量均有差異。由表4可知，發(fā)酵水豆豉中生物胺含量的顯著差異與原料裝載量、發(fā)酵或儲(chǔ)存時(shí)間有關(guān)。

提取上表中酪胺、尸胺、組胺的數(shù)據(jù)繪制成折線圖，與不同發(fā)酵時(shí)間氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行比對(duì)，見圖4～圖7。

圖4 氨基酸態(tài)氮含量變化曲線Fig.4 The curves of amino acid nitrogen content

圖5 酪胺含量變化曲線Fig.5 The curves of tyramine content

從圖4～圖7可以發(fā)現(xiàn)，從發(fā)酵48h起，豆豉中氨基酸態(tài)氮含量存在著先大幅增加再緩慢下降的趨勢(shì)，由于是自然發(fā)酵，所以隨著時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)菌繁殖，可能有脫羧酶的微生物參加，而導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮出現(xiàn)后期下降的現(xiàn)象。

圖6 尸胺含量變化曲線Fig.6 The curves of cadaverine content

圖7 組胺含量變化曲線Fig.7 The curves of histamine content

豆豉中酪胺的含量與氨基酸態(tài)氮的含量變化存在著一致性，這也從一定程度上反映了和驗(yàn)證了之前關(guān)于氨基酸態(tài)氮是生物胺產(chǎn)生的條件之一的說法。發(fā)酵初期豆豉中的游離氨基酸含量越高，產(chǎn)生生物胺的可能性就越大。而尸胺含量在發(fā)酵72 h隨著氨基酸態(tài)氮含量的增加達(dá)到最高值，之后驟降到相對(duì)穩(wěn)定的較低值。組胺含量從發(fā)酵48 h起逐漸上升，雖然沒有在含量上明顯表現(xiàn)出和氨基酸態(tài)氮的一致性，但是其含量的上升可能消耗了游離氨基酸而導(dǎo)致了氨基酸態(tài)氮后期的緩慢下降，因此細(xì)菌性豆豉自然發(fā)酵過程中要控制發(fā)酵時(shí)間，不然可能會(huì)因?yàn)榻M胺生成造成安全隱患。

2.5 對(duì)照材料中生物胺的含量

3個(gè)樣品中生物胺的含量測(cè)定結(jié)果如表5所示。

根據(jù)表5數(shù)據(jù)可知，所測(cè)定樣品中均未檢出精胺和亞精胺。臘八豆含有4種生物胺，但是含量較低;豆鼓的生物胺含量較低，種類少，油辣椒豆豉生物胺含量最少，僅含有少量的色胺。色胺能夠引起高血壓，然而許多國(guó)家都沒有對(duì)色胺制定限量標(biāo)準(zhǔn)［14］。

與自然發(fā)酵細(xì)菌性豆豉工藝比較，豆豉、臘八豆一般采用接種米曲霉或者毛霉發(fā)酵，加上均有油炸或炒制工藝和其他配料，這類產(chǎn)品中生物胺的含量較低。

表5 幾種發(fā)酵豆制品樣品中生物胺的含量Table 5 Biogenic amine content in several fermented soy products

3 結(jié)論

細(xì)菌型豆豉發(fā)酵過程中的發(fā)酵時(shí)間、裝載量以及發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮的含量有著直接的影響，而氨基酸態(tài)氮是生物胺生成的條件之一。豆豉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的對(duì)人體危害較大的組胺和酪胺都與氨基酸態(tài)氮的含量有一定相關(guān)性，從發(fā)酵48 h起，豆豉中酪胺的含量與氨基酸態(tài)氮的含量都存在著先大幅增加再緩慢下降的趨勢(shì)。但是總體來說，細(xì)菌型豆豉發(fā)酵過程中的生物胺均在國(guó)家規(guī)定的最大范圍之內(nèi)(組胺50～100 mg/kg，酪胺100～800 mg/kg)，理論上對(duì)人體不具有生理危害，但也應(yīng)注意，由于組胺含量一直處于上升趨勢(shì)，細(xì)菌型豆豉自然發(fā)酵過程中要控制發(fā)酵時(shí)間，不然可能會(huì)因?yàn)榻M胺生成造成安全隱患，豆豉發(fā)酵過程中也應(yīng)優(yōu)化其發(fā)酵條件來抑制生物胺的生成，進(jìn)一步降低其含量。

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