柴菊華，孫曉偉，崔彥志，侍朋寶，朱鳳妹

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島066600；2.朗格期酒莊秦皇島有限公司，河北秦皇島066600）

白藜蘆醇（Resveratrol），又稱芪三酚，化學名稱為3，4，5-三羥基-1，2-二苯乙烯，分子式為 C14H12O3，相對分子量為228.25，是葡萄酒中重要的功能性成分，具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗過敏、抗血栓、抗高血脂、消炎、掃除自由基等多種藥理活性，受到國內(nèi)外醫(yī)學界和葡萄酒研究者的廣泛關(guān)注[1-9]。根據(jù)研究報道，葡萄品種、產(chǎn)區(qū)、釀造工藝、貯藏條件等因素影響葡萄酒中白藜蘆醇的含量[10－20]。本文通過HPLC法檢測了昌黎產(chǎn)區(qū)不同品種、年份和工藝釀造的葡萄酒中白藜蘆醇含量，為生產(chǎn)高白藜蘆醇含量葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

共29種葡萄酒，其中玫瑰香干白酒由河北科技師范學院釀酒工藝實驗室提供，其余28種酒樣均由朗格斯酒莊提供。

1.1.1 干紅葡萄酒

2008年年份酒：4種，分別是赤霞珠傳統(tǒng)罐貯和桶貯干紅酒、赤霞珠閃蒸罐貯和桶貯干紅酒；2009年年份酒：12種，包括赤霞珠傳統(tǒng)瓶貯和桶貯干紅酒，赤霞珠閃蒸瓶貯和桶貯干紅酒，品麗珠傳統(tǒng)和閃蒸瓶貯酒樣，北玫、西拉、馬貝克、小味兒多、馬瑟蘭、美樂傳統(tǒng)瓶貯干紅酒；2010年年份酒：2種，赤霞珠傳統(tǒng)和閃蒸瓶貯干紅酒。

1.1.2 干白葡萄酒

2010年年份酒：11種，即賽美蓉、白詩南、維奧尼、胡桑、增芳德、小芒森、霞多麗、雷司令、長相思、阿拉耐爾、玫瑰香瓶貯干白酒。

1.2 儀器

LC1200高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；AP-01P真空泵：天津市津南開發(fā)區(qū)南洋工業(yè)園；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；Synergy超純水機：法國Millipore公司；FA 2004 B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司。

1.3 試劑

分析純乙酸乙酯；色譜純冰醋酸和甲醇；娃哈哈純凈水；反式白藜蘆醇標樣，純度為98%。

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的繪制

1）反式白藜蘆醇標準曲線：準確稱取反式白藜蘆醇標準品2 mg，用色譜甲醇定容至10 mL，再分別配制成一定質(zhì)量濃度的系列標準溶液，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾上機測定。

2）順式白藜蘆醇的標準曲線：準確稱取反式白藜蘆醇標準品4 mg，用色譜甲醇定容至10 mL，再分別配制成一定質(zhì)量濃度的系列標準溶液，經(jīng)紫外線照射30 min，低溫靜置5 d，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾后上機測定。

1.4.2 色譜條件

結(jié)合參考文獻與實驗室現(xiàn)有工作基礎，稍加改進，確定色譜條件：色譜柱為反相色譜柱Eclipse XDB C-18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇：1%乙酸水=35∶65（體積比）；流速為 1.0 mL/min；反式白藜蘆醇檢測波長為320 nm，順式白藜蘆醇檢測波長為305 nm；柱溫為30℃；進樣量為5 μL；DAD檢測器。

1.4.3 重復性試驗

采用標準品和酒樣溶液，重復進樣5次，得出峰時間和峰面積，計算RSD值。

1.4.4 酒樣中白藜蘆醇的提取

取50 mL葡萄酒，加50 mL乙酸乙酯，搖動萃取15 min，靜置分層后分液，將有機相40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘留物用甲醇溶解定容至10 mL。上機測定前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。操作過程中注意避光。

2 結(jié)果和分析

2.1 檢測波長的選擇

通過DAD檢測器在200 nm～400 nm范圍內(nèi)對順反式白藜蘆醇標樣溶液進行光譜掃描，得到其光譜圖見圖1，圖1顯示出兩種同分異構(gòu)體的光譜圖差異不大。用紫外分光光度計對2種標樣溶液在波長190 nm～400 nm區(qū)間內(nèi)掃描，紫外吸收光譜圖顯示，2種標樣的最大吸收波長各不相同，反式白藜蘆醇的最大吸收波長是320 nm，順式白藜蘆醇的最大吸收波長是305nm。因此，分別選取320 nm和305 nm作為檢測反式和順式白藜蘆醇的檢測波長。

圖1 反式（A）和順式（B）白藜蘆醇的DAD光譜圖Fig.1 The DAD spectrum of trans-and cis-Resveratrol standards

2.2 標樣和酒樣色譜分離效果

反式白藜蘆醇在320 nm下的保留時間和順式白藜蘆醇在305 nm下的保留時間非常接近，均在10 min左右，所以不宜采用切換波長的方法進行同時測定，應設定兩個波長分別進行色譜分析。標樣和酒樣在選定色譜條件下峰形對稱，響應值大，無雜質(zhì)干擾和基線漂移現(xiàn)象，色譜分離效果很好，見圖2。

2.3 白藜蘆醇標準曲線

以濃度為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，計算得到2條標準曲線：反式白藜蘆醇的濃度在0.5 mg/L～10mg/L之間，線性方程為Y=18. 9227829×X+0. 9602643，相關(guān)系數(shù)r=0. 99926；順式白藜蘆醇濃度在5 mg/L～200 mg/L之間，線性方程為Y=16. 2068315×X-5. 0812315，r=0. 99992。白藜蘆醇在研究范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能夠滿足定量分析的要求。

表1 標樣和酒樣重復性實驗結(jié)果（n=5）Table 1 Results of repeated experiment of standard and a wine sample（n=5）

圖2 標樣和酒樣白藜蘆醇色譜圖Fig.2 Chromatoragrams of standard and a wine sample

2.4 重復性實驗

取2 mg/L反式白藜蘆醇標樣、20 mg/L順式白藜蘆醇標樣和2009年閃蒸赤霞珠瓶貯酒樣，連續(xù)測定5次，標樣和酒樣保留時間和峰面積相對標準偏差結(jié)果見表1。從表1可以看出順反式白藜蘆醇保留時間和峰面積重復性較好，保留時間的標準偏差在0.10%～0.12%，峰面積的標準偏差在0.95%～2.79%。

2.5 單品種干紅葡萄酒白藜蘆醇含量比較

2009年年份8種單品種干紅葡萄酒（瓶貯18個月）的白藜蘆醇含量存在顯著差異見表2：馬瑟蘭干紅酒反式白藜蘆醇含量最高，為6.22 mg/L，其次為美樂干紅酒，含量為0.93 mg/L，赤霞珠、品麗珠、小味兒多、北玫干紅酒中反式白藜蘆醇含量很少，西拉和馬貝克干紅酒未檢測出反式白藜蘆醇；美樂干紅酒順式白藜蘆醇含量最高，為34.52 mg/L，其次為西拉和馬瑟蘭干紅酒，含量分別為5.87 mg/L和5.57 mg/L，后面依次為馬貝克＞北玫、赤霞珠＞品麗珠、小味兒多；從白藜蘆醇總量看，美樂干紅酒高居首位，含量為35.45 mg/L，具有很高的醫(yī)療保健作用，其次是馬瑟蘭干紅酒，含量為11.79mg/L，后面依次為酉拉＞馬貝克＞北玫、赤霞珠＞品麗珠、小味兒多；干紅酒中反式白藜蘆醇含量明顯低于順式白藜蘆醇含量，僅占白藜蘆醇總量的12.19%，順式白藜蘆醇占總量的87.81%。

表2 8種單品種干紅葡萄酒白藜蘆醇含量Table 2 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in eight dry red wines mg/L

2.6 單品種干白葡萄酒白藜蘆醇含量比較

陳釀6個月的11種單品種干白葡萄酒的白藜蘆醇含量有顯著差異見表3：增芳德順式、反式和總白藜蘆醇含量最高，分別為0.22、0.61、0.83 mg/L，其次為霞多麗干白酒，后面按白藜蘆醇總量排序依次為：胡桑＞玫瑰香＞阿拉耐爾＞雷司令＞小芒森＞長相思＞白詩南＞賽美蓉，維奧尼干白酒未檢測到白藜蘆醇。干白葡萄酒反式與順式白藜蘆醇平均含量分別占平均總量的57.69%和42.31%，但均遠遠低于干紅葡萄酒，分別為干紅葡萄酒的15.31%和1.56%，白藜蘆醇總量僅為干紅葡萄酒的3.23%。

表3 11種單品種干白葡萄酒白藜蘆醇含量Table 3 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in eleven dry white wines mg/L

2.7 閃蒸與傳統(tǒng)干紅葡萄酒白藜蘆醇含量比較

閃蒸工藝顯著提高干紅葡萄酒白藜蘆醇含量見表4：2008年～2010年閃蒸赤霞珠干紅酒分別比傳統(tǒng)赤霞珠干紅酒白藜蘆醇總量提高了35.61%、318.31%和57.48%；2009年閃蒸品麗珠干紅酒分別比傳統(tǒng)品麗珠干紅酒白藜蘆醇總量提高了436.60%；閃蒸干紅酒白藜蘆醇總量比傳統(tǒng)干紅酒平均提高了118.45%。閃蒸處理提高白藜蘆醇含量的效果與年份、葡萄品種、制作工藝、貯藏方式等因素有關(guān)。

表4 閃蒸和傳統(tǒng)紅葡萄酒白藜蘆醇含量Table 4 Concentration of trans-and cis-Resveratrol in dry red wines made by flash realease technology and traditional technology mg/L

3 結(jié)論

1）29種葡萄酒平均反式白藜蘆醇含量為0.66 mg/L，占總量的7.99%，順式白藜蘆醇含量為4.53mg/L，占92.01%。

2）8種單品種干紅酒的白藜蘆醇含量存在明顯差異，平均白藜蘆醇含量為8.04 mg/L，總量范圍在1.29 mg/L～34.52 mg/L，其中美樂干紅酒含量最高，其次是馬瑟蘭和西拉干紅酒。

3）11種單品種干白酒的白藜蘆醇含量存在明顯差異，平均白藜蘆醇含量為0.26 mg/L，總量范圍在0 mg/L～0.83 mg/L，其中增芳德干白酒含量最高。

4）干紅酒白藜蘆醇含量遠遠高于干白葡萄酒，平均含量是其30.92倍。

5）6種閃蒸干紅酒白藜蘆醇平均含量為9.59 mg/L，而對照（6種傳統(tǒng)干紅酒）平均含量僅為4.39 mg/L，閃蒸工藝提高白藜蘆醇含量118.45%。

4 討論

反式白藜蘆醇標準溶液經(jīng)紫外光直接照射30min，之后檢測其中的反式白藜蘆醇含量，發(fā)現(xiàn)反式標樣尚未轉(zhuǎn)化。靜置3 d～5 d后，意外發(fā)現(xiàn)320 nm檢測條件下檢測不到反式標樣，而305 nm檢測條件下出現(xiàn)了較大吸收峰，說明反式白藜蘆醇已完全轉(zhuǎn)化成順式白藜蘆醇，但其相應濃度的峰面積有所減小。另外，白藜蘆醇標樣和酒樣提取液應盡快上機測定，否則可能由于長時間存放導致白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化影響測定結(jié)果的準確性。今后應進一步試驗反式白藜蘆醇標樣完全轉(zhuǎn)化成順式白藜蘆醇標樣的優(yōu)化條件、順反式白藜蘆醇糖苷的快速檢測方法。

昌黎是我國第一個受到原產(chǎn)地保護的沿海地域，紫外線輻射強，葡萄生長季節(jié)氣候涼爽濕潤，對白藜蘆醇形成有利[9，11，13，16]。昌黎產(chǎn)區(qū)可選擇高產(chǎn)白藜蘆醇的優(yōu)良品種美樂、馬瑟蘭、西拉等品種，在氣候條件允許的前提下盡量提高原料成熟度，結(jié)合閃蒸工藝等措施，開展高白藜蘆醇含量葡萄酒生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的集成研究，開發(fā)保健優(yōu)質(zhì)特色干紅葡萄酒。

[1] 李華．葡萄酒化學[M]．北京：科學出版社，2005

[2] 耿華田．話說葡萄酒中的抗癌明星－白藜蘆醇[J]．化學教育，2007,(9)：8-10

[3] 郭景南,劉崇懷,潘興,等.葡萄屬植物白藜蘆醇研究進展[J].果樹學報,2002,19(3)：199-204

[4] 劉婭,王光慈.白藜蘆醇生理活性作用研究進展[J].中國食品添加劑,2002,6(2)：19-21

[5] 劉兆平,霍君生.白藜蘆醇生物學作用[J].國外醫(yī)藥學衛(wèi)生學分冊,2002,29(3)：146-148

[6] 胡躍.白藜蘆醇抗腫瘤作用研究新進展[J].國外醫(yī)學腫瘤學分冊,2002,6(4)：174-177

[7] Christian Imark,Markus Kneubuhl,Stefan Bodmer.Occurrence and activity of natural antioxidants in herbal spirits[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies.2001,1(4)：239-243

[8] Alben Y sun,Agnes simonyi,Grace Y sun.The"French paradox"and beyond：neuroprotective effects of polyphenols[J].Free Radical Biology&Medicine.2002,32(4)：314-318

[9] 李環(huán)宇,王君高,蘇峰,等．葡萄酒中白藜蘆醇與人體健康[J]．中國釀造,2009(7)：20-22

[10]于貞,張影陸,趙光鰲．葡萄酒中白藜蘆醇的分析[J]．工業(yè)微生物．2001(4)：34-36

[11]王勁松．葡萄與葡萄酒中白藜蘆醇的含量及其影響因素[J]．寧夏農(nóng)林科技,2003(6)：81-83

[12]薛潔．山葡萄酒中白藜蘆醇含量的測定[J]．釀酒科技,2004,(5)：103-104

[13]李記明,趙光鰲,樊璽,等．干紅葡萄酒中白藜蘆醇的含量與分布[J]．中外葡萄與葡萄酒,2004,(2)：8-10,14

[14]馬麗艷,劉彥雷,梁學軍,等．貯藏條件對葡萄酒中白藜蘆醇的影響[J]．中外葡萄與葡萄酒,2005,(6)：8-12

[15]張?。n工藝對干紅葡萄酒中白藜蘆醇含量的影響[J]．食品研究與開發(fā),2006,(11)：21-22

[16]張健,高年發(fā)．影響干紅葡萄酒白藜蘆醇含量的因素分析[J]．中國釀造,2007,(2)：12-15

[17]劉達雄,欒玉明,區(qū)偉全,等．國產(chǎn)葡萄酒中白藜蘆醇含量分析[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,(12)：2813-2814

[18]張美玲,高年發(fā),王樹生,等．橡木桶陳釀對紅葡萄酒中白藜蘆醇含量的影響[J]．中國釀造,2008,(3)：20-22

[19]張城,于涼云．高效液相色譜法測定葡萄酒和葡萄干中白藜蘆醇的含量[J]．化工時刊,2008,(12)：39-41

[20]俞然,尹吉泰,邢凱,等．葡萄品種、產(chǎn)區(qū)及釀造工藝對酒中白藜蘆醇的影響[J]．中外葡萄與葡萄酒,2009,(7)：17-19