徐兵，楊昌亮，鄭麗雪，冀宏

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

白靈菇（Pleurotusnebrodensis）又名白阿魏菇、阿魏側(cè)耳、白靈側(cè)耳，屬于擔(dān)子菌綱，傘菌目，側(cè)耳科側(cè)耳屬[1-2]，是干旱草原上具有代表性的珍貴食（藥）用真菌[3]。白靈菇的藥用價值很高，它含有真菌多糖和維生素等生理活性物質(zhì)及多種礦物質(zhì)，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、食用纖維和多種礦質(zhì)元素。具有調(diào)節(jié)人體生理平衡，增強(qiáng)人體免疫功能、防治兒童佝僂病、老年人心血管疾病等藥用功效[4]。

目前白靈菇的生產(chǎn)多采用傳統(tǒng)的固體栽培方式，子實(shí)體形成條件苛刻，栽培周期長、產(chǎn)量低，大規(guī)模提取多糖受到限制，難以滿足市場需求。液體深層發(fā)酵技術(shù)比傳統(tǒng)的食用菌生產(chǎn)方式有明顯的優(yōu)越性，在短時間內(nèi)能產(chǎn)生大量的菌絲體和代謝產(chǎn)物[5-6]。本研究通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基來提高菌絲體的產(chǎn)量，以期為白靈菇液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

山東壽光720：購于山東壽光市食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[7]。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖3.0%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.15%，MgSO40.1%。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

斜面種子培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室的菌種，接種到試管斜面培養(yǎng)基上，放入25℃恒溫箱，待菌絲長滿后，存放冰箱供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

液體種子培養(yǎng)：250 mL三角瓶內(nèi)裝入80 mL的液體種子培養(yǎng)基，進(jìn)行常規(guī)滅菌，待冷卻后，接入已經(jīng)活化的菌種，并置于搖床上培養(yǎng)，在25℃、160 r/min條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2 發(fā)酵試驗(yàn)

250 mL三角瓶內(nèi)裝入80 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行常規(guī)滅菌，待冷卻后，按照10%接種量接入活化好的液體菌種，在25℃、160 r/min條件下培養(yǎng)8 d。

1.2.3 碳源選擇實(shí)驗(yàn)

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源2.0%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.15%，MgSO40.05%。分別以玉米粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源。發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)菌絲體生物量確定出最佳碳源。

1.2.4 氮源選擇實(shí)驗(yàn)

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，氮源0.5%，KH2PO40.15%，MgSO40.05%。分別以酵母粉、尿素、麩皮、硫酸銨、蛋白胨作為氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。根據(jù)菌絲體生物量確定出最佳氮源。

1.2.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取最佳的碳、氮源、KH2PO4、MgSO4設(shè)計四因素三水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 The table of factor and level in orthogonal experiment%

1.2.6 菌絲體生物量的測定

將發(fā)酵液通過80目標(biāo)準(zhǔn)篩過濾，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，將過濾所得菌絲體于60℃干燥箱中烘干至恒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對白靈菇菌絲生物量的影響

不同碳源對白靈菇菌絲生物量的影響見圖1。

圖1 不同碳源對菌絲體生物量的影響Fig.1 Effects of carbon sources on mycelia biomass

由圖1可知，白靈菇對碳源的要求并不特別苛刻，既能夠利用吸收成分復(fù)雜的復(fù)合碳源，也能利用單糖、雙糖等小分子碳源。由圖可知，以葡萄糖作為碳源時菌絲體生物量最高，可溶性淀粉作為碳源時菌絲產(chǎn)量最低。葡萄糖作為一種高效碳源可以被白靈菇菌絲直接吸收利用，能夠縮短延遲期。葡萄糖是最佳碳源和李正鵬、林毅[8]等人報道的結(jié)果一致，因此選擇葡萄糖作為正交試驗(yàn)中的碳源。

2.2 不同氮源對白靈菇菌絲生物量的影響

不同氮源對白靈菇菌絲生物量的影響見圖2。

由圖2可知選擇不同氮源時菌絲體產(chǎn)量也是不同的，白靈菇對不同氮源的吸收能力有一定差異，在以蛋白胨為碳源時菌絲產(chǎn)量最高，以尿素為氮源時菌絲產(chǎn)量最少。氮源是食用菌細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸等所需氮元素的主要來源，蛋白胨作為一種高效氮源可以被菌絲直接吸收利用，故選用蛋白胨作為正交設(shè)計試驗(yàn)中的氮源。

圖2 不同氮源對菌絲體生物量的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on mycelia biomass

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)L9（34）極差分析Table 2 Orthogonal experiment L9（34）range analysis

由表2可以看出，不同組合之間菌絲體生物量是不同的。各因素對菌絲干重影響的大小依次為葡萄糖＞MgSO4＞KH2PO4＞蛋白胨。極差越大，起的作用就越大，說明葡萄糖是影響菌絲體生物量的最主要因素，KH2PO4影響最小。從菌絲體生物量來考察各因素水平值，A 取 A3，B 取 B2，C 取 C3，D 取 D2。因此，選定最適碳氮源及無機(jī)鹽培養(yǎng)基組合為A3B2C3D2，即葡萄糖3.0%，蛋白胨0.4%，KH2PO40.3%，MgSO40.2%。按照此配方進(jìn)行白靈菇菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后80 mL發(fā)酵液中菌絲體生物量為1.27 g，與正交試驗(yàn)預(yù)測值基本一致。

3 結(jié)論

經(jīng)優(yōu)化后，白靈菇（山東壽光720）液體發(fā)酵培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為葡萄糖3.0%，蛋白胨0.4%，KH2PO40.3%，MgSO40.2%，在培養(yǎng)溫度25℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵培養(yǎng)時間8 d、接種量10%、裝液量80 mL/250 mL的條件下，菌絲體生物量達(dá)1.27 g/80 mL。通過對白靈菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選及優(yōu)化，旨在為白靈菇的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 曹玉清.阿魏側(cè)耳某些生物學(xué)特性的初步研究[J].微生物學(xué)通報,1985，12（3)：97-601

[2] 吳衛(wèi)東,宋錫全,張貴權(quán).阿魏側(cè)耳組織分離[J].黔南名族師范學(xué)院學(xué)報,2003(6)：61-63

[3] 黃年來.中國大型真菌原色圖鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998

[4] 林杰.白靈菇栽培技術(shù)要點(diǎn)[J].中國食用菌,2000,19(5)：28-29

[5] 楊新美.食用茵研究法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998

[6] 朱戎,陳向,東蘭進(jìn).藥用真菌液體發(fā)酵研究進(jìn)展[J].中藥材,2003,26(1)：55-57

[7] 鄭麗雪,胡耀輝,齊斌.釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的培養(yǎng)條件的研究[J].食品科學(xué),2007,28(10)：391-394

[8] 李正鵬,林毅,蔡永萍,等.白靈菇液體發(fā)酵工藝[J].生物學(xué)雜志,2006,23(1)：28-30