喻瀘 王華 羅曉燕

他克莫司及金黃色葡萄球菌腸毒素B對特應(yīng)性皮炎外周血Th17細胞的影響

喻瀘 王華 羅曉燕

目的探討Th17細胞在急性期特應(yīng)性皮炎(AD)患兒外周血單一核細胞(PBMC)中的表達，他克莫司和金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)對AD患兒外周血Th17細胞的影響。方法分離急性期中、重度AD患兒及健康對照兒童PBMC，分別加入佛波酯和離子霉素、他克莫司、金黃色葡萄球菌腸毒素B培養(yǎng)，流式細胞儀檢測Th17、Th1、Th2細胞比例，ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-17、IFN-γ、IL-4表達，RT-PCR法檢測Th17特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達。結(jié)果佛波酯和離子霉素處理后，AD患兒外周血Th17、Th2細胞比例及相關(guān)細胞因子IL-17、IL-4水平明顯高于健康對照組(P＜0.01)。Th1細胞比例及IFN-γ水平低于健康對照組(P＜0.01)，ROR γt mRNA高于健康對照組(P＜0.01)。 他克莫司處理后，AD組和對照組IL-17、IFN-γ、IL-4及ROR γt mRNA水平均顯著降低(P＜0.01)。SEB處理后，AD組Th17細胞比例，IL-17和RORγt mRNA水平顯著高于對照組(P＜0.01)，Th1細胞比例及IFN-γ水平低于對照組(P＜0.01)，Th2細胞比例及IL-4水平高于對照組(P＜0.01)。結(jié)論他克莫司對AD患兒和健康對照PBMC分泌IL-17、IFN-γ、IL-4均有明顯的抑制作用。SEB增強AD患兒外周血Th17細胞表達。

皮炎，特應(yīng)性；他克莫司；葡萄球菌，金黃色；腸毒素類；Th17細胞

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種與遺傳有關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，主要見于兒童和青少年，目前該病在發(fā)達國家患病率已接近20%[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，Th17細胞參與慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等發(fā)病。AD患者存在皮膚屏障功能缺陷，伴有金黃色葡萄球菌(金葡菌)定植增加，金葡菌腸毒素B(SEB)作為超抗原能加重AD炎癥，而Th17細胞在此過程中是否發(fā)揮免疫防御機制值得探討。他克莫司作為一種免疫抑制劑，能緩解AD急性期炎癥，是否通過抑制Th17細胞分化途徑實現(xiàn)治療目的尚不清楚。本研究旨在探討Th17細胞在AD患兒外周血中的表達，他克莫司、SEB對外周血Th17細胞的影響。

對象與方法

一、對象

2011年11月至2012年11月于我院皮膚科門診就診的急性期AD患兒86例，其中男50例，女36例，年齡(0.25～14.75)歲，平均(5.39±4.04)歲，所有AD患兒均符合Hanifin-Rajka標(biāo)準(zhǔn)[2]，用歐洲特應(yīng)性皮炎SCORAD評分標(biāo)準(zhǔn)對疾病嚴重度指數(shù)進行評估(總分103)，評分33～80，平均56.12±11.85。且在2周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素類藥物以及口服抗組胺藥物，4周內(nèi)未接受系統(tǒng)糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療。對照組81例均為本院體檢的健康兒童，其中男48例，女 33例，年齡(2.92～14.08)歲，平均(5.65±2.02)歲，無特應(yīng)性疾病史。本研究通過重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家長簽署知情同意書。

二、試劑與儀器

1.主要試劑：佛波酯和離子霉素(ionomycin)購于美國Alexis公司，他克莫司、SEB購于美國Sigma公司，淋巴細胞分離液購于天津TBD公司，胎牛血清購于美國Hyclone公司，RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Gibeco公司，異硫氰基熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CD8單抗、藻紅蛋白-吲哚菁(PE-Cy5)標(biāo)記的抗人CD3單抗 、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的同型對照IgG1單抗購于北京四正柏公司，藻紅蛋白標(biāo)記的抗人腫瘤壞死因子 γ(IFN-γ)、白介素 4(IL-4)，白介素 17(IL-17)單抗購于美國Ebioscience公司，細胞固定/破膜劑(Cytofix/Cytoperm)、細胞洗劑(Perm/Wash)、高爾基體阻斷劑莫能霉素(Gal-stop monensin)購于美國BD公司。Trizol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，RORγt mRNA引物購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，PCR熒光染料(SsoFast EvaGreen Supermix)購于美國Bio-Rad公司，抗人 IFN-γ、IL-4、IL-17 ELISA 試劑盒購于美國CBS公司。

2.主要儀器：FACSCalibur流式細胞儀購于美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司，ELISA檢測儀購于美國BioTek公司。

三、方法

1.標(biāo)本與細胞分離：急性期中、重度AD患兒及健康對照兒童外周血5 ml，肝素或EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單一核淋巴細胞(PBMC)，重懸于含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度至2×109/L，培養(yǎng)于24孔板。

2.流式細胞儀檢測Th細胞亞群：取上述細胞懸液(2×109/L)1 ml置于24孔板，分別加入佛波酯(50 μg/L)+離子霉素(1 mg/L)、金葡菌腸毒素B(20 mg/L)及莫能霉素(1 μmol/L)終濃度，37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(佛波酯+離子霉素組4 h、金葡菌腸毒素B組24 h)，移細胞懸液至1.5 ml微量離心管，1500 ×g，離心 5 min，棄上清，PBS洗2次后行流式細胞儀分析。Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)。

3.ELISA檢測培養(yǎng)上清細胞因子：分別加入佛波酯(50 μg/L)、離子霉素(1 mg/L)終濃度、他克莫司(1 μg/L)終濃度，金葡菌腸毒素B(1 mg/L)終濃度，37 ℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h，1500 ×g，離心5 min，收集上清，-80℃保存。同時收集細胞沉淀至1.5 ml去酶微量離心管中。

4.實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測RORγt mRNA：于上述細胞沉淀中加入Trizol裂解液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，染料法(EvaGreen)進行相對熒光定量。RORγt引物設(shè)計為F：5'-GTGCTGGTTAGGATGTGCCG-3'，R：5'-GTGG GAGAAGTCAAAGATGGA-3'，135 bp。 內(nèi)參 GAPDH引物設(shè)計為F：5'-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG C-3'，R：5'-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGTGTC-3'，116 bp。通過建立RORγt mRNA和GAPDH mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得各樣本CT值(Y軸)與起始相對拷貝數(shù)的log值(X軸)曲線斜率slope和相關(guān)系數(shù)R2。擴增效率E=[10-1/slope-1]×100%。用美國Bio-Rad公司Gene Expression Analysis for iCycle iQ?實時PCR Detection System軟件，計算各樣本目的基因相對表達量。

5.統(tǒng)計分析：用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料均使用±s表示，組間比較用兩獨立樣本t檢驗，各組年齡比較用方差分析，性別比較用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血Th17/Th1/Th2細胞比例

佛波酯+離子霉素刺激培養(yǎng)PBMC 4 h，細胞膜表面標(biāo)記和胞內(nèi)細胞因子染色，流式細胞儀測定結(jié)果顯示，AD患兒組(n=86)CD3+CD8-IL-17+(Th17)細胞比例高于健康對照組(n=81，P＜0.01)；CD3+CD8-IFN-γ+(Th1) 細胞比例低于健康對照組(P＜0.01)；CD3+CD8-IL-4+(Th2)細胞高于健康對照組(P＜0.01)。金葡菌腸毒素B(20 mg/L)刺激培養(yǎng)PBMC 24 h，流式細胞儀測定結(jié)果顯示，AD患兒組Th17細胞比例高于健康對照組(P＜0.05)；Th1細胞比例低于對照組(P＜0.01)；Th2細胞比例高于對照組(P＜0.01)。見圖1。

二、金葡菌腸毒素B對細胞培養(yǎng)上清IL-17/IFN-γ/IL-4的影響

金葡菌腸毒素B(1 mg/L)刺激PBMC 24 h，ELISA檢測IL-17/IFN-γ/IL-4結(jié)果顯示，AD組IL-17、IL-4水平明顯高于健康對照組(P＜0.01)，IFN-γ水平明顯低于健康對照組(P＜0.01)。見表1。

三、金葡菌腸毒素B對RORγt mRNA表達的影響

金葡菌腸毒素B(1 mg/L)刺激PBMC 24 h，RTPCR法檢測RORγt mRNA表達結(jié)果顯示，金葡菌腸毒素B處理后AD組(22例)明顯高于健康對照組(18例)(1.51±1.05比0.39±0.28，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

四、他克莫司對培養(yǎng)上清細胞IL-17/IFN-γ/IL-4的影響

佛波酯 +離子霉素加或不加他克莫司(1 μg/L)刺激培養(yǎng) PBMC 24 h，ELISA 檢測培養(yǎng)上清細胞因子，結(jié)果顯示，佛波酯+離子霉素處理后AD組IL-17和IL-4水平明顯高于健康對照組，IFN-γ水平低于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；佛波酯 +離子霉素+他克莫司處理后AD組和健康對照組IL-17、IFN-γ、IL-4水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

五、他克莫司對RORγt mRNA表達的影響

佛波酯+離子霉素加或不加他克莫司(1 μg/L)處理PBMC 24 h，RT-PCR法檢測RORγt mRNA表達結(jié)果顯示，佛波酯 +離子霉素處理后AD組RORγt mRNA表達明顯高于健康對照組(P＜0.01)；佛波酯+離子霉素+他克莫司處理后AD組和健康對照組RORγt mRNA表達均顯著降低(P＜0.01)。見表3。

討 論

Th17細胞的主要特點是產(chǎn)生IL-17A(IL-17)、IL-17F、IL-22和IL-6等炎性細胞因子，其中以IL-17A為主。另外，Th17細胞的分化不依賴于Th1、Th2細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3，孤核受體(Orphan nuclear receptor，RORγt)是調(diào)控其分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[3]。IL-17是Th17細胞參與AD的主要效應(yīng)細胞因子，Th17細胞可能通過增強Th2細胞功能、促進多種炎癥因子分泌、增強角質(zhì)形成細胞免疫活性等途徑參與AD病理生理過程。

表1 金葡菌腸毒素B處理后白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

注：a：與健康對照組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) 白介素17 腫瘤壞死因子γ 白介素4健康對照組 24 284.23±84.69 943.98±254.07 274.51±48.67特應(yīng)性皮炎組 24 593.50±119.16a548.46±99.70a462.71±109.63a

圖1 表達白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4的T細胞分析 1a：同型對照IgG設(shè)門；1b：表達白介素17；1c：表達腫瘤壞死因子γ；1d：表達白介素4

表2 他克莫司處理前后白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

表2 他克莫司處理前后白介素17、腫瘤壞死因子γ、白介素4水平(±s) pg/ml

注：a：與健康對照組比較，P＜0.01；b：與佛波酯+離子霉素組比較，P＜0.01

組別 例數(shù)佛波酯+離子霉素+他克莫司健康對照組 22 369.57±107.22 147.66±67.69b 1123.66±218.36 380.67±128.54b 294.30±59.01 134.12±34.71b特應(yīng)性皮炎組 22 638.01±152.85a 160.87±65.63b 653.53±133.80a 305.87±86.16b 537.15±160.73a 161.36±33.48b白介素17 腫瘤壞死因子γ 白介素4佛波酯+離子霉素佛波酯+離子霉素+他克莫司佛波酯+離子霉素佛波酯+離子霉素+他克莫司佛波酯+離子霉素

表3 他克莫司處理前后ROR γt mRNA表達(±s)

表3 他克莫司處理前后ROR γt mRNA表達(±s)

注：a：與健康對照組比較，P＜0.01；b：與佛波酯 +離子霉素組比較，P＜0.01

組別 例數(shù) 佛波酯+離子霉素佛波酯+離子霉素+他克莫司健康對照組 22 0.83±0.44 0.20±0.18b特應(yīng)性皮炎組 24 2.64±2.31a 0.26±0.23b

本研究結(jié)果顯示，AD患兒外周血Th2細胞和IL-4水平明顯高于健康對照組，Th1細胞及IFN-γ水平低于對照組，提示急性期AD患兒外周血存在Th2細胞高表達。AD患者存在Th2細胞及相關(guān)細胞因子IL-4表達增加，Th1細胞及IFN-γ水平相對降低[4-5]，我們發(fā)現(xiàn)，急性期AD患兒外周血Th17細胞和IL-17表達也顯著高于對照組，與Koga等[6]報道結(jié)果相同。另外，我們還發(fā)現(xiàn)AD患兒外周血Th17細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA水平顯著高于健康對照兒童。

研究報道，他克莫司能顯著抑制正常人PBMC產(chǎn)生炎性細胞因子 IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ 和 TNF-α，在自身免疫性疾病的研究中，人們也發(fā)現(xiàn)他克莫司具有抑制初始T細胞向Th1、Th2、Th17細胞分化，減少其相關(guān)細胞因子合成的作用[7-8]。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)他克莫司在早期移植物排斥反應(yīng)中對Th1、Th2、Th17細胞并無明顯抑制作用。Chung等[10]則發(fā)現(xiàn)他克莫司可抑制Th1和Th2細胞反應(yīng)，并呈劑量依賴性，而對Th17細胞無論濃度多大均無抑制作用。因此，他克莫司對Th17細胞有無抑制作用尚存爭議。本研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司明顯降低AD患兒和健康對照兒童外周血Th1、Th2細胞表達，減少IFN-γ和IL-4生成，同時對AD患兒及健康對照兒童Th17細胞均有明顯抑制作用，減少IL-17合成，同時對Th17細胞關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA表達也有顯著抑制作用，提示他克莫司通過抑制Th17細胞分化可能是實現(xiàn)緩解AD急性炎癥的途徑之一。

已知AD患者皮膚表面有大量金葡菌定植，金葡菌超抗原金葡菌腸毒素B能使初始CD4+T細胞前體向Th2細胞分化，產(chǎn)生B細胞級聯(lián)反應(yīng)，促使大量IgE產(chǎn)生，遷移至皮膚，Th2細胞釋放的IL-4、IL-5趨化嗜酸性粒細胞向炎癥部位皮膚聚集，繼而產(chǎn)生IL-1，IL-6和IL-17，后者可正反饋加強Th2細胞數(shù)量及分化規(guī)模，從而參與AD急性炎癥進程[11]。本研究結(jié)果顯示，金葡菌腸毒素B體外刺激PBMC后，與健康對照相比，AD患兒組Th2細胞亞群及其相關(guān)因子IL-4表達升高。Ma等[12]發(fā)現(xiàn)，Th17細胞缺陷的個體更易受金葡菌感染，AD患者皮膚斑貼試驗處分離出來的浸潤性T細胞可產(chǎn)生IL-17。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，金葡菌腸毒素B對IL-17產(chǎn)生具有促進作用，提示Th17細胞可能對抗金葡菌感染有一定的防御作用。我們發(fā)現(xiàn)，金葡菌腸毒素B處理后AD組患兒Th17細胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA和IL-17水平均顯著高于對照組，提示Th17/IL-17可能是金葡菌腸毒素B加重AD炎癥的途徑之一，為此我們下一步擬對IL-17受體進行阻斷后證實。

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2013-08-20)

(本文編輯:吳曉初)

Effect of tacrolimus andStaphylococcus aureusenterotoxin B on T helper 17 cells in peripheral blood from patients with atopic dermatitis

Yu Lu，Wang Hua，Luo Xiaoyan.Department of Dermatology，Children's Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400014，China

Luo Xiaoyan，Email:luoxycq@hotmail.com

ObjectiveTo determine the proportion of T helper 17(Th17)cells in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)from children with acute atopic dermatitis(AD)，and to evaluate the effect of tacrolimus andStaphylococcus aureusenterotoxin B(SEB)on the proportion.MethodsPBMCs were separated from 86 children with moderate to severe acute AD and 81 healthy children，and cultured in the presence of phorbol ester(PMA)and ionomycin with or without tacrolimus or SEB for different durations.Then，flow cytometry was performed to determine the proportions of Th17，Th1 and Th2 cells，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to measure the levels of interleukin(IL)-17，interferon(IFN)-γ and IL-4 in the culture supernatant of these cells，and real-time fluorescence-based quantitative PCR(RT-PCR)to detect the expression level of RORγt mRNA.Statistical analysis was done by using two independent samplest-test，chi-square test and analysis of variance.ResultsAfter stimulation with PMA and ionomycin，there was a significant increase in the proportions of Th2 and Th17 cells in，supernatant levels of IL-17 and IL-4 and mRNA expression level of RORγt of，but a significant decrease in Th1 cell percentage in and IFN-γ supernatant level of，PBMCs from patients with AD compared with PBMCs from the healthy controls(allP＜0.01).The combination treatment with tacrolimus significantly reduced the supernatant levels of IL-17，IFN-γ，IL-4 and RORγt mRNA expression level of PBMCs from both the patients and healthy controls compared with those treated with PMA and ionomycin only(allP＜0.01).In comparison with the healthy controls，the patients with AD showed significantly higher proportions of Th17 and Th2 cells in，supernatant levels of IL-17 and IL-4 of，and expression level of RORγt mRNA of，but significantly lower proportion of Th1 cells in and IFN-γ supernatant level of，PBMCs after SEB treatment(allP＜0.01).ConclusionsTacrolimus evidently inhibits the secretion of IL-17，IFN-γ and IL-4 by PBMCs from both children with AD and healthy children，while SEB can up-regulate the proportion of peripheral blood Th17 cells in children with AD.

Dermatitis，atopic；Tacrolimus；Staphylococcus aureus；Enterotoxins；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.011

重慶市衛(wèi)生局面上項目(2009-2-242)；2010年中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病分會-安斯泰來皮膚病學(xué)研究基金

400014重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科

羅曉燕，Email：luoxycq@hotmail.com