郭利平 王曉彥

84株感染相關(guān)皮膚病MRSA SCCmec分型及PVL毒素檢測

郭利平 王曉彥

目的探討感染相關(guān)皮膚病耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的SCCmec基因型別及PVL毒素攜帶情況。方法分離于感染相關(guān)皮膚病MRSA菌株及其相關(guān)信息，對所收集到的菌株利用PCR方法進(jìn)行mecA鑒定，mecA陽性者確定為實驗對象，再通過多重PCR的方法進(jìn)行SCCmec基因分型及PVL毒素的測定。結(jié)果共收集95株MRSA，經(jīng)鑒定mecA陽性者為84株，其中有5株攜帶PVL毒力基因。有69株為SCCmecⅢ型，占 86.3%(69/84)，有 3株為 SCCmecⅠ型，占 3.6%(3/84)，有 8株為 SCCmecⅣ型，占 9.52%(8/84)，其余4株為不可分型，占4.8%(4/84)。未發(fā)現(xiàn)SCCmecⅡ、Ⅴ兩型。結(jié)論感染相關(guān)皮膚病MRSA以HA-MRSA為主，SCCmec分型大部分為Ⅲ型，CA-MRSA及HA-MRSA均可攜帶PVL毒素。

感染；皮膚；基因，SCCmec；PVL毒素

1961年Jevons在英國首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)，20世紀(jì)60年代中期 MRSA擴(kuò)展到歐洲許多國家及加拿大，20世紀(jì)70年代末急劇增多遍及全世界，成為全球性問題[1]。隨著耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcus aureus，VRSA)的出現(xiàn)，MRSA 的治療更加棘手。20世紀(jì)90年代開始，社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)感染現(xiàn)象有所增多，與醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)不同，這種MRSA經(jīng)常在沒有醫(yī)院經(jīng)歷和院內(nèi)感染可能的健康人群(多數(shù)為小孩)中分離獲得，而且呈增長的趨勢[2]。它是導(dǎo)致皮膚及軟組織感染的主要原因，另外，CA-MRSA攜帶殺白細(xì)胞毒素(panton-valentine leukocidin，PVL)，PVL 常見于CA-MRSA引起的嚴(yán)重的深部皮膚感染等[3]。我們通過分離皮膚軟組織感染相關(guān)皮損的MRSA進(jìn)行SCCmec基因分型及PVL毒素的檢測，探討本院感染相關(guān)皮膚病流行株的SCCmec型別，為治療MRSA感染提供一定依據(jù)。

材料與方法

一、菌株來源

收集內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2010年6月至2012年7月，與皮膚軟組織感染相關(guān)的皮損分泌物(包括感染性皮膚病其他科室與皮膚感染相關(guān)疾病，如手術(shù)切口感染，褥瘡等)及其臨床資料(包括患者姓名、性別、皮損初發(fā)部位及臨床診斷)，同時測定其C-反應(yīng)蛋白(CRP)，培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌且CRP陽性者確定為致病菌[4]，最終得出致病性金黃色葡萄球菌338例，其中MRSA 95例，所有菌株均為非重復(fù)菌株，同一患者同一部位只取1次分離株。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌 ATCC25923，MRSAATCC43300均來自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科細(xì)菌室。

二、主要試劑及儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒、溶葡球菌酶、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、100 bp DNA Ladder、 瓊脂糖、核酸染料均購自南京博爾迪生物科技有限公司。試驗所用引物均參照相關(guān)文獻(xiàn)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增儀(PTC-100)、DYY-6C型電泳儀、電泳成像分析系統(tǒng)等由內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院分子實驗室提供。

三、方法

1.臨床標(biāo)本取材：開放性感染和已破潰的化膿灶：先用生理氯化鈉液沖洗表面的污染菌，用無菌拭子取化膿組織與正常組織交界處的膿液及皮損深部的分泌物，立即送檢。閉鎖性膿腫：先用2.5%的碘伏及75%的乙醇消毒膿腫表面及周圍皮膚，然后用無菌注射器穿刺取其內(nèi)容物，立即送檢。

2.MRSA基因組DNA模板提?。簩⒁褍龃娴木曛匦陆臃N在哥倫比亞血平板上，置37℃溫箱中孵育18～24 h。用滅菌環(huán)從血平板上挑取8～10個復(fù)活菌落溶于300 μl的溶葡萄球菌酶中，分別標(biāo)號后置37℃溫箱水浴30 min，取出放入100℃沸水中小火煮沸10 min，10 800×g離心5 min，然后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的第3步操作開始提取DNA，最后保存在-20℃冰箱中。

3.mecA基因檢測：①mecA基因擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn) [5]合成：MECAP4：5'-TCCAGATTACAACTT CACCAGG-3'，MECAP7：5'-CCACT TCATATCTTGTAAGG-3'，擴(kuò)增片段大小約為162 bp；②PCR擴(kuò)增條件為94℃初變性 4 min，94℃變性30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸4 min，1.5%瓊脂糖電泳。

4.SCCmec基因分型：參照Boye等[6]方法，用多重PCR的方法對MRSA菌株進(jìn)行SCCmec分型，所用引物見表1。結(jié)果判讀方式：SCCmecⅠ型只顯示415 bp條帶，SCCmecⅡ型只顯示 937 bp條帶，SCCmecⅢ型只顯示518 bp條帶，SCCmecⅣ型同時顯示415 bp和937 bp條帶，SCCmecⅤ型同時顯示359 bp和518 bp條帶。

5.PVL基因測定：①PVL基因擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)[7]合成：Luk-PV-1：5'-ATCATTAGGTAAAATGA CTGGACATGATCCA-3'，Luk-PV-2：5'-GCATCAAS TGTATTGGATAGCAAAAG-3'，擴(kuò)增片段大小約為433 bp；②PCR擴(kuò)增條件為94℃初變性4 min，94 ℃變性30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸4 min，1.5%瓊脂糖電泳。

結(jié) 果

1.mecA基因檢測結(jié)果：復(fù)活的95例MRSA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，mecA基因陽性的為84株。結(jié)合臨床資料分析，CA-MRSA有21例，HA-MRSA有63例，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

2.SCCmec基因分型多重PCR擴(kuò)增結(jié)果：利用多重PCR的方法對mecA陽性的84株MRSA進(jìn)行SCCmec基因Ⅰ-Ⅴ型擴(kuò)增，其分型結(jié)果見表2。SCCmec基因分型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物部分電泳圖見圖2。

表1 SCCmec分型所用引物

圖1 mecA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～19：菌株編號，10、12、13、19號菌株mecA基因陰性，其余均為陽性

表2 SCCmec基因分型結(jié)果(株)

圖2 SCCmec基因分型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1，33：SCCmecⅣ型； 9：SCCmecⅠ型； 10 ～ 12，16，20 ～ 25，29 ～ 30，37：SCCmecⅢ型； 31： 未分型； +：SCCmecⅢ型陽性對照；-：陰性對照

3.PVL基因檢測結(jié)果：對84株MRSA進(jìn)行PVL基因特異性擴(kuò)增后，共檢測出5株P(guān)VL基因陽性的菌株，占5.6%(5/84)，其中CA-MRSA有3株，占所有收集的CA-MRSA菌株的14.3%(3/21)，HAMRSA有2株，占所有收集的HA-MRSA菌株的3.2%(2/63)。對這兩組MRSA菌株P(guān)VL表達(dá)率做χ2檢驗分析，P＞0.05。PVL基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段為433 bp。

討 論

SCCmec是耐藥性基因插入、堆積的部位，主要由mecA基因復(fù)合體、盒式染色體重組酶基因和無功能區(qū)(J區(qū))三部分構(gòu)成[8]。依據(jù)mecA和盒式染色體重組酶基因復(fù)合體的多態(tài)性目前SCCmec可分為Ⅰ～Ⅴ型，根據(jù)J區(qū)的不同又可以分為不同的亞型。SCCmecⅠ、SCCmecⅡ和SCCmecⅢ型常存在于HA-MRSA中，可攜帶多個耐藥基因。SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型通常存在于CA-MRSA中，除了mecA基因外很少攜帶其他耐藥基因，因此CAMRSA通常不表現(xiàn)多重耐藥。

本次研究顯示，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚感染分離的MRSA有3型，分別為SCCmecⅠ型、SCCmecⅢ、SCCmecⅣ型，以 SCCmecⅢ型為主，與國內(nèi)其他地區(qū)及其他亞洲國家報道結(jié)果一致。其中SCCmecⅢ型中有57株為HA-MRSA，多數(shù)為骨科創(chuàng)口感染所致，12株為CA-MRSA，這可能與SCCmec分型存在地區(qū)差異有關(guān)，但也不能排除此12株CAMRSA為HA-MRSA的可能性。SCCmecⅣ型均為CA-MRSA，來源于皮膚科門診，分別為癤腫2例，蜂窩組織膿腫1例，蟲咬皮炎合并感染1例，濕疹合并感染4例。

PVL是由攜帶PVL基因金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種外毒素，由S和F蛋白組成，是金葡菌的重要致病因子[9]。本研究顯示，84株MRSA中共檢測出5株P(guān)VL陽性的菌株，占5.9%，與國內(nèi)報道一致。其中 CA-MRSA 3株，HA-MRSA 2株，經(jīng)χ2檢驗分析P＞ 0.05，CAMRSA與HA-MRSA兩組菌株P(guān)VL基因表達(dá)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義?；仡櫯R床資料分析，這3株CAMRSA均來自皮膚科門診，1例為癤腫，1例為蜂窩組織膿腫，1例為蟲咬皮炎合并感染，經(jīng)抗生素治療預(yù)后良好，但較其他未攜帶PVL毒素的患者恢復(fù)較慢。本研究只對SCCmecI-V型基因進(jìn)行擴(kuò)增，而未對其他新型別的基因進(jìn)行擴(kuò)增。我們在分型過程中有4株不可分型，可能是除這5型以外的其他型別。

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2013-05-05)

(本文編輯：吳曉初)

Staphylococcal cassette chromosome mec typing of and detection of PVL gene in 84 methicillin-resistantStaphylococcus aureusisolates from patients with infectious skin diseases

Guo Liping*，Wang Xiaoyan.*Department of Dermatology，Center Hospital of Erdos City，Erods 017000，Inner Mongolia，China

Wang Xiaoyan，Email:xiaoyan4766@hotmail.com

ObjectiveTo determine staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec)types and detect panton-valentine leukocidin(PVL)gene in methicillin-resistantStaphylococcus aureus(MRSA)isolates from patients with infectious skin diseases.MethodsStaphylococcus aureuswas isolated from lesion exudate of patients with infectious skin diseases between June 2010 and July 2012 in different departments of Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University.General and medical information on the patients was collected as well.PCR was performed to detect mecA gene in MRSA strains，and multiplex PCR was conducted to determine SCCmec type and detect PVL gene in mecA gene-positive strains.ResultsA total of 95 MRSA strains were isolated from these patients with infectious skin diseases，and mecA gene was found in 84 out of these strains.Among these mecA-positive strains，5 carried PVL gene，69(86.3%)were identified as SCCmec type Ⅲ，3(3.6%)as SCCmec typeⅠ，8(9.52%)as SCCmec type Ⅳ，4(4.8%)were non-typeable，and no strain was identified as SCCmec typeⅡ orⅤ.ConclusionsHospital-acquired(HA)-MRSA predominates in MRSA strains causing infectious skin diseases，with SCCmec typeⅢas the major SCCmec type.Both HA and community-acquired(CA)MRSA strains carry PVL toxin.

Infection；Skin；Genes，SCCmec；PVL toxin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.009

017000內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市中心醫(yī)院皮膚科(郭利平)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科(王曉彥)

王曉彥，Email：xiaoyan4766@hotmail.com