趙海燕 黃海霞 劉 萍 張思韜 鈕偉真 王 偉*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院機能教研室，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京100069)

動脈壓力感受性反射是機體維持血壓穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)機制之一，該反射的感受器是分布于頸動脈竇和主動脈弓的神經(jīng)末梢，其主要作用是將血壓變化對血管壁的機械牽張刺激轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛑袠袀鲗?dǎo)的神經(jīng)沖動——即機械-電轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。早有文獻(xiàn)［1-2］報道，竇神經(jīng)和主動脈神經(jīng)由A類和C類2種神經(jīng)纖維組成。1969年，F(xiàn)idone等［2］通過測量貓竇神經(jīng)壓力感受纖維的興奮傳導(dǎo)速度，從功能上證明A類和C類纖維均參與壓力信息的傳遞。1977年，Thoren等［3］比較了家兔竇神經(jīng)2種神經(jīng)纖維的壓力-反應(yīng)關(guān)系(pressure-discharge relationship)的特點，發(fā)現(xiàn)2類纖維在閾壓(pressure threshold Pth)、閾壓時的放電頻率(threshold frequency Fth)、最高放電頻率、壓力敏感性等方面均存在差異。這種差異陸續(xù)在不同動物、不同條件下以及不同感受部位(頸動脈竇或主動脈弓)得以證實［4-9］。壓力感受器A類和C類纖維的這種差異提示壓力感受器機電換能機制可能存在一定差異，其差異的分子基礎(chǔ)值得探討。普遍認(rèn)為壓力感受器由機械敏感離子通道介導(dǎo)［10］。然而，由于動脈壓力感受器結(jié)構(gòu)細(xì)微和缺乏特異性機械敏感通道阻斷劑，使得動脈壓力感受器機電換能過程的分子機制難于確定。有報道［11-16］認(rèn)為退行性蛋白/上皮鈉通道/酸敏感通道(degenerin/epithelial sodium channels/acid-sensing ion channels DEG，ENaC，ASICs)和瞬時感受器電位通道(transient receptor potential，TRPs)兩大超家族中的某些成員可能參與動脈壓力感受器的機電換能過程。為進(jìn)一步研究動脈壓力感受器的機電換能機制，本研究組曾研究多種相關(guān)工具藥(Gd3+、氨基甙類抗生素、阿米洛利、釕紅等)對動脈壓力感受器機電換能過程的阻斷作用［17-18］。TRP 通道家族中 TRPV1、TRPV4、TRPA1、TRPC1、TRPC3、TRPC6等多個成員被認(rèn)為具有機械敏感性［10-11］，可被釕紅阻斷［11］。本研究組［10］曾發(fā)現(xiàn) 100 μmol/L 釕紅能完全阻斷竇神經(jīng)放電，但沖洗后不能恢復(fù)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不同的竇神經(jīng)纖維對釕紅(20 μmol/L)的反應(yīng)存在差異，可區(qū)分為釕紅敏感和釕紅不敏感纖維。深入分析還發(fā)現(xiàn)這2類纖維的電生理特點分別與C類和A類壓力感受器相對應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 頸動脈竇-竇神經(jīng)標(biāo)本的制備

采用SPF級成年大耳白家兔(體質(zhì)量2 kg左右)，雌雄不拘，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，實驗動物許可證號:SCXK(京)2013-0004。在20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氨基甲酸乙酯(5 mL/kg)靜脈麻醉下，于動物頸部正中切口，游離一側(cè)頸動脈竇區(qū)。制備以頸內(nèi)外動脈分支點為中心，包括頸總動脈(7 mm)、頸內(nèi)動脈(5 mm，遠(yuǎn)端結(jié)扎)、頸外動脈(5 mm)和竇神經(jīng)(7 mm)的組織，簡稱頸動脈竇-竇神經(jīng)(carotid sinus-carotid sinus nerve，CS-CSN)標(biāo)本。

1.2 標(biāo)本灌流和頸動脈竇內(nèi)壓力的控制

在實驗中采用自制的離體標(biāo)本灌流-放電記錄裝置，同時從血管內(nèi)外2條途徑對標(biāo)本進(jìn)行灌流。血管內(nèi)外的灌流液相同，溫度控制在37℃。實驗中持續(xù)用100%O2平衡灌流液，目的在于維持灌流液處于高O2分壓和零CO2分壓狀態(tài)，以便充分抑制來自頸動脈體化學(xué)感受器的放電［8-9］。在研究［12］中通過計算機控制頸動脈竇內(nèi)壓力，計算機輸出壓力指令程序化控制壓力調(diào)節(jié)閥(PRE-U，Hoerbiger，德國)，該閥門進(jìn)而控制高壓純氧(0.5 MPa)瓶的流量并輸出預(yù)定氣壓。此壓力用于推動儲液瓶中的灌流液進(jìn)入頸動脈竇內(nèi)，同時控制竇內(nèi)壓。竇內(nèi)灌流速度為5 mL/min。竇內(nèi)灌流液出口處安置壓力換能器(YH-4，北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所，中國)，用于記錄竇內(nèi)壓。頸動脈竇竇外灌流速度為1 mL/min。

1.3 壓力感受器放電的記錄

首先記錄竇神經(jīng)干放電，然后在體視顯微鏡下，用游絲鑷將竇神經(jīng)干分成神經(jīng)纖維細(xì)束，以單極記錄法引導(dǎo)含少量竇神經(jīng)纖維的放電［19］。本研究將含有2～5個單位的混合放電稱為少纖維放電(few-fiber discharge)［19］。所有記錄的放電均顯示壓力依賴性。神經(jīng)放電信號經(jīng)前級(A1 402，Axon instrument，美國)、后級(CyberAmp380，Axon instrument，美國)放大和濾波，電壓總增益為5 000倍，頻帶300 Hz～10 kHz。放大后的放電信號和竇內(nèi)壓信號由數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(Digidata 1440，pClamp 10.0，Axon instrument，美國)采集(采樣率為20 kHz)。

1.4 竇神經(jīng)單位放電信息的提取與處理

對頸動脈竇先后施加脈動式(100次/min，周期0.6 s，壓力80 ～ 120 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)和斜坡式(0 ～200 mmHg，20 mmHg/s)的壓力刺激，同時記錄不同刺激波條件下竇神經(jīng)的少纖維放電。在離線條件下，應(yīng)用Spike2軟件(Cambridge Electronic Design Limited，英國)將少纖維放電分類為若干個單纖維的放電［13］。對于每一單位放電，先計算脈動式刺激條件的平均放電頻率。在斜坡式壓力刺激下，確定每一纖維開始放電的初始壓力，即壓力閾值(pressure threshold，Pth)［7-9］。然后擬合斜波壓力刺激下的時間-放電頻率曲線［5，8］。對于后者以指數(shù)方程Y=Fsat×［1-exp(-x/τ)］擬合［5］。方程中 Y 是神經(jīng)纖維放電的頻率，F(xiàn)sat為飽和放電頻率(saturation frequency)或最大放電頻率，τ為時間常數(shù)，x為時間。

1.5 灌流液成分與藥物的應(yīng)用

普通灌流液(mmol/L):NaCl 140，KCl 6，MgSO41.2，Glucose 5.5，CaCl21.1 和Hepes 10。釕紅 (ruthenium red，RR;Sigma公司，美國)灌流液以普通灌流液配制，終濃度20 μmol/L。以上灌流液均以Hepes-NaOH調(diào)節(jié)，pH值在37℃時為7.38～7.42。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用Prism 4.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表達(dá)，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析法進(jìn)行比較，繼之行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 釕紅對竇神經(jīng)放電的抑制作用

以普通灌流液灌流標(biāo)本，在脈動式竇內(nèi)壓(intrasinusal pressure，ISP)條件下，竇神經(jīng)神經(jīng)干特征性地呈簇狀放電，放電頻率的時間序列直方圖顯示放電頻率與竇內(nèi)壓顯著相關(guān)(圖1)。用含20 μmol/L釕紅的灌流液對標(biāo)本灌流30 min后，竇神經(jīng)放電活動被部分阻斷(圖1b)，以普通灌流液沖洗30 min后放電可基本恢復(fù)。灌流20 μmol/L釕紅30 min，平均使竇神經(jīng)放電下降至對照組的(67±2)%(P＜0.01，n=5)。

圖1 釕紅對頸動脈竇壓力感受器放電的影響Fig.1 Effects of ruthenium red(RR)on the discharge of carotid baroreceptors

2.2 壓力感受纖維放電對釕紅反應(yīng)的差異

1例脈動性壓力刺激下竇神經(jīng)少纖維放電，應(yīng)用Spike2軟件進(jìn)行聚類分析，分解出3根單纖維的放電(圖2A①～③)。所有纖維放電活動均顯示明確的壓力依賴性，表明所有單纖維均屬于壓力感受性纖維。實驗中從6只家兔的竇神經(jīng)中各記錄到1例少纖維放電。經(jīng)Spike2軟件聚類分析，確認(rèn)其中有1根細(xì)束含有2根單纖維，另一細(xì)束含4根單纖維、另外4根細(xì)束各含3個單纖維，共計18根單纖維。在20 μmol/L釕紅作用下，每個標(biāo)本中均有1根纖維的放電被明顯抑制(如圖2A③b)，平均放電頻率由(8.33±3.50)次/壓力周期下降至(3.5±1.75)次/壓力周期 (n=6，P ＜0.05，圖2B)，洗脫后恢復(fù)至(7.5±3.15)次/壓力周期。這些被釕紅明顯抑制的纖維稱為釕紅敏感纖維。在圖2A中，單位①和②對釕紅不敏感。在12根纖維，在應(yīng)用釕紅前、后及洗脫后的平均放電頻率分別為(16.50±3.75)、(16.01±3.86)和(16.25±3.41)次/壓力周期(n=12，P＞0.05，圖2C)，表明這些纖維對釕紅不敏感。

2.3 釕紅敏感和不敏感纖維的功能差異

圖3和圖2記錄于同一竇神經(jīng)細(xì)束，在斜坡壓力周期的間歇期(壓力為零)以及壓力處于較低水平時，記錄不到任何放電，放電僅在出現(xiàn)在竇內(nèi)壓力超過一定水平后，這些特征進(jìn)一步證明所記錄的放電內(nèi)不包含化學(xué)感受纖維放電成分，而完全屬于壓力感受纖維的放電。應(yīng)用Spike2軟件對斜坡壓力下的放電進(jìn)行分類，得到與圖2同樣的3個單位放電，每個單位依次在不同壓力水平開始放電，表明每根纖維具有各自的壓力閾值(Pth)。隨著壓力升高，3根纖維分別在83.32、90.18 和101.09 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)下開始放電，其中單位③的壓力閾值最高。在應(yīng)用釕紅的實驗中，單位③已被確定為釕紅敏感纖維;而單位①和②屬于釕紅不敏感纖維(圖2)。測量所有釕紅敏感纖維的壓力閾值(Pth)，結(jié)果為(95.61±7.13)mmHg(n=6)，而不敏感纖維的壓力閾值為85.64±6.63 mmHg(n=12)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。同時，釕紅敏感纖維的最大放電頻率(35.28±1.82 Hz，n=6)低于釕紅不敏感纖維［(50.52±1.47)Hz，n=12］，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0081)。此外，本研究還比較了2種纖維在脈動性壓力周期內(nèi)的平均放電。應(yīng)用指數(shù)方程擬合神經(jīng)纖維的壓力-放電頻率曲線［7-9］，通過擬合曲線獲得了纖維放電的半激活壓力(P50)，比較后發(fā)現(xiàn)，釕紅敏感纖維的P50為(131.3±3.28)mmHg(n=6)，而釕紅不敏感纖維的 P50為(118.5±3.66)mmHg(n=12，P=0.045)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。感受器的壓力敏感性可以用擬合曲線的時間常數(shù)(τ)來表示，時間常數(shù)越大表示壓力敏感性越低。釕紅敏感纖維的τ為(0.85±0.070)s(n=6);釕紅不敏感纖維的τ為(0.69±0.089)s(n=12，P=0.748)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。釕紅敏感和不敏感纖維在電生理特征性方面的差異匯總于表1。

圖2 不同竇神經(jīng)纖維對釕紅反應(yīng)的差異Fig.2 Effects of ruthenium red(RR)on discharges of different baroreceptor fibers

3 討論

本室前期的研究［13］成果以及本實驗表明，應(yīng)用Spike2軟件對竇神經(jīng)少纖維放電(纖維數(shù)＜5)進(jìn)行聚類分析可獲得分類相當(dāng)可靠的單纖維放電數(shù)據(jù)。這種分類方法不但使獲得單纖維放電信息變得相對容易，同時提供一種可能，即可在同樣實驗條件下對不同單纖維(如A類和C類纖維)的特點進(jìn)行觀察，然后再施加完全相同的干預(yù)，這樣就使所獲得的各種數(shù)據(jù)(如有關(guān)釕紅作用的結(jié)果)更具可比性，分析也更為可靠。

圖3 不同竇神經(jīng)纖維壓力閾值的差異Fig.3 Pressure threshold(Pth)of different fibres discharge of sinus nerve

表1 釕紅敏感纖維與非敏感纖維在“壓力-放電”關(guān)系中的一些特征性參數(shù)的差異Tab.1 Different pressure-discharge relationship characteristics of RR sensitive fiber and RR insensitive fiber

研究［2］早已證明，竇神經(jīng)和主動脈神經(jīng)中的壓力感受性纖維包括A類和C類兩種。有髓鞘的A類神經(jīng)纖維直徑較粗且傳導(dǎo)速度快，而直徑較細(xì)的無髓鞘C類神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度較慢［2-5］。自1977年以來，不同研究［3-9］從功能上比較了兩種神經(jīng)纖維的壓力-放電關(guān)系(pressure-discharge relationship)，發(fā)現(xiàn)兩類纖維在閾壓、最大放電頻率等方面均存在差異。Coleridge等［9］報道，在狗頸動脈竇壓力感受器，A類和C類纖維的壓力閾值分別為(54.6±2.9)和(105.8±1.8)mmHg，而最大放電頻率分別為(84.3±4.5)和(24.5 ±1.2)Hz。然而，對于同樣動物，Seagard 等［5］曾報道，頸動脈竇壓力感受器單纖維表現(xiàn)為兩種放電模式，一些纖維僅在壓力上升至某一水平后才開始放電(被稱為type 1)，而另一些在低壓力下呈低頻率放電，只有當(dāng)壓力上升至一定程度，放電頻率才顯著升高(稱為Type 2)。值得注意Seagard的2類放電都可能來自A類和C類纖維，其第一類放電中A類和C類纖維的閾值分別為(71.4±5.0)和(80.4±13.3)mmHg，最大放電頻率分別為(49.7±2.7)和(32.7±4.6)Hz，而在第二類放電中A類和C類纖維的閾值分別為(57.1±10.1)和(63.6±4.6)mmHg，最大放電頻率分別為(17.3±3.0)和(20.5±3.0)Hz。對于家兔，Yao等［8］曾報道，頸動脈竇壓力感受器C類纖維的放電頻率低于A類纖維、C類纖維的壓力閾值為(92±3)mmHg，A纖維的閾值較C類纖維大約低30 mmHg。此后，Thoren等［3］再次報道，家兔壓力感受器A類和C類纖維的壓力閾值分別為(53±2)和(95±3)mmHg，最大放電頻率分別為(65±5.8)和(22.7±2.3)Hz。除了Seagard的第2類放電模式的最大放電頻率外，上述研究的共同特點是A類纖維比C類纖維的閾值低而放電頻率高。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于釕紅敏感纖維，釕紅不敏感纖維閾值低(85.64±6.63 vs 95.61±7.13 mmHg)且最大放電頻率高(50.52±1.74 vs 5.28±1.82 Hz)。這一結(jié)果提示釕紅不敏感纖維和敏感纖維可能分屬于A類和C類神經(jīng)纖維。

釕紅可阻斷TRP家族中TRPC、TRPA、TRPV亞家族中多個可能具有機械敏感性的通道成員［11，13］，因此成為研究動脈壓力感受器的機電換能機制過程中的重要工具藥物。單細(xì)胞實驗條件下，釕紅阻斷TRP通道的有效濃度在 100 nmol/L～20 μmol/L之間［11，13］。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，高濃度釕紅(100 μmol/L)能完全阻斷竇神經(jīng)放電［17-20］，本研究在組織水平實驗發(fā)現(xiàn)，竇神經(jīng)不同壓力感受纖維在同時面對20 μmol/L釕紅作用時，呈現(xiàn)不同的反應(yīng)——一些竇神經(jīng)纖維的活動被釕紅抑制，而另外一些竇神經(jīng)纖維則不受影響。結(jié)合釕紅不敏感和敏感纖維分別與A類和C類神經(jīng)纖維的對應(yīng)特點，作者認(rèn)為這2類壓力感受器的機-電換能機制可能存在某些差異。TRP通道家族和退行性蛋白/上皮鈉通道/酸敏感通道家族的某些成員可能參與動脈壓力感受器的機械-電轉(zhuǎn)導(dǎo)過程［11-16］，由于缺乏研究通道的特異性工具藥，目前還很難確定其機械-電轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制。釕紅主要用于TRP家族通道的研究，雖然屬于非特異性通道的阻斷劑，但是釕紅敏感和不敏感纖維的存在可能有助于推測動脈壓力感受器不同纖維機械電-轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的通道家族屬性。尋找特異性通道阻斷劑，綜合研究動脈壓力感受器A類和C類纖維的各種藥理學(xué)差異，將有助于闡明其轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的本質(zhì)。

［1］ Douglas W W，Ritchie J M，Schaumann W.Depressor reflexes from medullated and nonmedullated fibres in the rabbit's aortic nerve［J］.Physiol:Lond，1956，132(2):187-198.

［2］ Fidone S J，Sato A.A study of chemoreceptor and baroreceptor A and C-fibres in the cat carotid nerve［J］.Physiol，1969，205(3):527-548.

［3］ Thoren P，Saum W R，Brown A M.Mechanisms for activation of aortic baroreceptor C-fibres in rabbits and rats［J］.Acta Physiol Scand，1999，166(3):167-174.

［4］ Jennifer E，Angell-JAMES.Characteristics of single aortic and right subclavian baroreceptor fiber activity［J］.Circ Res，1973，32(2):149-161.

［5］ Seagard J L，van Brederode J F M，Dean C，et al.Firing characteristics of single-fiber carotid sinus baroreceptors［J］.Circ Res，1990，66(34):1499-1509.

［6］ Schild J H，Kunze D L.Differential distribution of voltage-gated channels in myelinated and unmyelinated baroreceptor afferents［J］.Auton Neurosci，2012，172(1-2):4-12.

［7］ Santa C，Chavez G C，Li B Y，et al.An afferent explanation for sexual dimorphism in the aortic baroreflex of rat［J］.Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(4):13-16.

［8］ Yao T，Thoren P.Characteristics of brachiocephalic and carotid sinus baroreceptors with non-medullated afferents in rabbit［J］.Acta Physiol Scand，1983，117(1):1-8.

［9］ Coleridge H M，Coleridge J C G，Schultz H D.Characteristics of C fiber baroreceptors in the carotid sinus of dogs［J］.J Physiol，1987，394:291-313.

［10］Goodman M B，Lumpkin E A，Ricci A，et al.Molecules and mechanisms of mechanotransduction［J］.Neurosci，2004，24(42):9220-9222.

［11］Bernd N，Veit M，F(xiàn)lockerzi.Mammalian transient receptor potential(TRP)cation channels［J］.Handb Exp Pharmacol，2014，223(1-2):729-1239.

［12］ Chanet S，Martin A C.Mechanical force sensing in tissues［J］.Prog Mol Biol Transl Sci，2014，126:317-52.

［13］ Plant T D.TRPs in Mechanosensing and volume regulation［J］.Handb Exp Pharmacol，2014，223:743-766.

［14］ McCleskey E W.A molecular sensor for the baroreceptorreflex?［J］.Neuron，2009，64(2):776-777.

［15］ Ben-Shahar Y.Sensory functions for degenerin/epithelial sodium channels(DEG/ENaC)［J］.Adv Genet，2011，76(4):1-26.

［16］ Ichikawa H T，Sugimoto.The co-expression of VR1 and VRL-1 in the rat vagal sensory ganglia［J］.Brain Res，2003，980(2):293-296.

［17］劉廷會，魏華，趙海燕，等.芐阿米洛利和釕紅對頸動脈竇壓力感受器放電的阻斷作用［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，32(2):218-223.

［18］劉東霞，鈕偉真，沈靖.氨基甙類抗生素對家兔離體頸動脈竇壓力感受器放電的抑制作用［J］.生理學(xué)報，2001，53(5):158-162.

［19］趙海燕，魏華，劉萍，等.竇神經(jīng)壓力感受器聚類分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，30(5):658-661.

［20］劉萍，趙海燕，王偉，等.頸動脈竇內(nèi)壓力控制方法的改進(jìn)［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，34(6):900-903.