洪芬芳，周 瑩，閔慶華，郭發(fā)先，陳小兵，吳麗夢(mèng)，楊樹龍*

(南昌大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理教研室；2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部 寄生蟲研究室；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室；4.附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江西 南昌 330006)

缺血預(yù)處理減少大鼠肝缺血再灌注損傷期間白三烯C4生成

洪芬芳1,2，周 瑩3，閔慶華4，郭發(fā)先1，陳小兵1，吳麗夢(mèng)1，楊樹龍1*

(南昌大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理教研室；2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部 寄生蟲研究室；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室；4.附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 江西 南昌 330006)

白三烯(leukotrienes,LTs)是經(jīng)5-脂氧化酶(5-lipoxygenase，5-LO)途徑產(chǎn)生的一類重要前炎癥花生四烯酸類物質(zhì)。它包括半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, Cys-LTs)(LTC4、LTD4 和LTE4)以及LTB4。Cys-LTs母體復(fù)合物L(fēng)TC4由肝微粒體白三烯C4合酶(leukotriene C4 synthase, LTC4S)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(microsomal glutathione S-transferase, mGST)mGST2和mGST3催化LTA4和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH) 結(jié)合而成[1]。肝臟缺血再灌注損傷(ischemia reperfushion, I/R)在肝移植和肝腫瘤切除外科手術(shù)中均存在[2]。許多研究提示，肝臟I/R損傷病理機(jī)制中涉及LTs。有最近報(bào)道，I/R損傷大鼠肝組織LTC4增加部分系由LTC4S表達(dá)上調(diào)和LTC4合成酶活力增加所致; 而后者主要是由于LTC4S而非mGST2和mGST3[2]。

缺血預(yù)處理(ischemia preconditioning, IP)是指肝臟短暫缺血應(yīng)激能減輕隨后的長(zhǎng)時(shí)間I/R損傷，并提高其再生能力[3]。一系列證據(jù)表明，IP 在肝移植等涉及I/R損傷的過程中具有保護(hù)作用[4]。但I(xiàn)P減輕肝臟I/R損傷的機(jī)制尚未完全闡明。它是否及如何影響大鼠肝I/R損傷期間前炎性因子LTC4生成未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料:清潔級(jí)雄性SD大鼠，250～300 g，18只，[南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，編號(hào)SCXK(贛)，2008-0001]。 LTA4甲酯、LTC4和前列腺素B2 (PGB2)(Cayman公司)。LTC4S多克隆抗體(Santa Cruz公司)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶檢測(cè)試劑盒(Kibbuz Beit Haemek公司)。DAB試劑盒、辣根過氧化物酶聯(lián)羊抗兔和羊抗鼠抗體(均北京中山生物有限公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 肝I/R損傷動(dòng)物模型：隨機(jī)將大鼠均分為3組：1)肝臟I/R組，按文獻(xiàn)[2]所述，采用Pringle’s操作方法制作大鼠肝臟I/R損傷模型。2)假手術(shù)對(duì)照組，只麻醉開腹，不阻斷肝臟血流；3)IP組，以短暫10 min缺血再灌注10 min作為IP處理，之后開始較長(zhǎng)時(shí)間60 min缺血和5 h再灌注。

1.2.2 LTC4含量的測(cè)定及免疫印跡分析：按文獻(xiàn)[1]，采用反向高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組肝組織中LTC4含量,及采用免疫印跡法檢測(cè)對(duì)照組、I/R和IP組肝組織LTC4S蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 免疫組化檢查：采用間接免疫過氧化物酶法，進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)LTC4S在對(duì)照組、I/R和IP組石蠟包埋大鼠肝組織切片表達(dá)和定位分布[1]。

1.2.4 LTC4合成酶的活性分析：取肝組織用超速離心法提取肝微粒體酶，在0.1 mol/L，pH 7.4磷酸鉀緩沖液中(終體積150 μL)，加底物10 mmol/L GSH和40 μmol/L LTA4 25 ℃孵化15 min后處理，做RP-HPLC分析[2]。

2 結(jié)果

2.1 IP對(duì)肝臟I/R期間LTC4含量和肝微粒LTC4合成酶活性的影響:與對(duì)照組相比，I/R組肝組織中LTC4含量和肝微粒LTC4合成酶的活性顯著增加(P<0.01)，IP組上述指標(biāo)顯著回降(P<0.05)(圖1)。

2.2 IP對(duì)大鼠肝臟I/R期間LTC4S蛋白表達(dá)的影響:I/R組LTC4S蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，IP組顯著回降(P<0.05) (圖2)。

2.3 免疫組化染色檢查IP對(duì)大鼠肝組織LTC4S表達(dá)定位分布的影響:對(duì)照組肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的LTC4S免疫陽性染色較低(圖3A,B)；I/R肝組織內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞LTC4S染色強(qiáng)陽性，并呈現(xiàn)出小葉分布異常(圖3C,D)，IP組大鼠肝組織LTC4S染色輕微陽性(圖3E,F)。

A.leukotriene C4 content; B.LTC4 synthesis activities of liver microsomes; *P<0.05 compared with control; #P<0.01 compared with I/R圖1 對(duì)照組、I/R和IP組大鼠肝LTC4的含量及肝微粒體LTC4合成酶活性變化Fig 1 Changes of hepatic Leukotriene C4 content and LTC4 synthesis activities of liver microsomes in control, I/R and IP groups rats (±s, n=6)

A.shows an immunoreactive band corresponding to LTC4S；B.depicts a histogram obtained by densitometric analysis of several immunoblots for LTC4S; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with I/R圖2 對(duì)照組、I/R和IP組大鼠肝組織LTC4S蛋白表達(dá)變化Fig 2 Changes of hepatic protein expressions of LTC4S in control, I/R and IP groups rats (±s, n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)I/R大鼠肝組織中LTC4生成增加， 與以前的報(bào)告一致[5]，還發(fā)現(xiàn)，IP處理顯著減少I/R損傷期間肝臟LTC4生成，這可能是IP防治肝臟I/R損傷的原因之一。

A,B.show immunohistochemical staining for LTC4S in normal rat liver; C,D.show immunohistochemical staining for LTC4S in I/R group rat liver (arrows); E,F.show immunohistochemical staining for LTC4S in IP group rat liver (arrows)(A,C,E:Bar=100 μm,B,D,F: Bar=50 μm)

圖3免疫組化檢測(cè)各組大鼠肝臟LTC4S蛋白表達(dá)和定位分布變化
Fig4ImmunohistochemicaldistributionsofLTC4Sincontrol,I/RandIPratliver

雖然曾有報(bào)道大鼠在3，12和24 h再灌注后，肝組織中LTC4S的mRNA表達(dá)無顯著變化[5]，但筆者最近研究表明，LTC4的生成增加可能部分與肝I/R期間LTC4S過度表達(dá)有關(guān)[2]。為了進(jìn)一步闡明IP減少肝I/R損傷期間LTC4生成的機(jī)制，作者檢測(cè)了IP對(duì)I/R損傷肝臟LTC4S的表達(dá)和定位分布的影響。結(jié)果顯示，肝臟再灌注5 h后，I/R組，而不是IP處理組大鼠肝LTC4S蛋白表達(dá)較未處理組明顯增加； IP組LTC4S蛋白表達(dá)與I/R組相比則顯著下降。LTC4S在I/R組大鼠肝臟中血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞有較強(qiáng)的陽性表達(dá)，但在IP組，大鼠肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中僅顯示輕微LTC4S染色陽性。這些結(jié)果表明，IP減少LTC4生成可能涉及其下調(diào)大鼠I / R損傷肝臟中LTC4S蛋白表達(dá)。

LTC4合成酶(LTC4S，mGST2和mGST3)都能共軛結(jié)合LTA4和GSH生成LTC4，其mRNA和蛋白質(zhì)在大鼠肝臟均有表達(dá)。本研究曾報(bào)道，肝臟I /R期間LTC4堆積可能部分由LTC4合成酶活性增加造成，其中，主要是由于LTC4S所致[2]。有理由設(shè)想IP降低LTC4生成，也可能與其改變LTC4合成酶的活性有關(guān)。本研究證實(shí)，IP顯著降低肝I/R損傷大鼠肝微粒部分LTC4合成酶的活性，表明IP降低LTC4的形成可能與其在I/R過程中抑制肝LTC4合成酶的活性有關(guān)。

[1] Yang SL, Lou YJ. Sodium nitroprusside decreased leukotriene C4 generation by inhibiting leukotriene C4 synthase expression and activity in hepatic ischemia-reperfusion injured rats[J]. Biochem Pharmacol,2007,73:724- 735.

[2] Yang SL, Huang X, Chen HF,etal. Increased leukotriene c4 synthesis accompanied enhanced leukotriene c4 synthase expression and activities of ischemia-reperfusion-injured liver in rats[J]. J Surg Res, 2007,140:36- 44.

[3] Ambros JT, Herrero-Fresneda I, Borau OG,etal. Ischemic preconditioning in solid organ transplantation: from experimental to clinics[J]. Transpl Int, 2007,20:219- 229.

[4] Montalvo-Jave EE, Garcia-Puig MA, Escalante-Tattersfield T,etal. Biochemical analysis and lipid peroxidation in liver ischemic preconditioning[J]. Cirugia y cirujanos, 2011,79:132- 140.

[5] Takamatsu Y, Shimada K, Chijiiwa K,etal. Role of leukotrienes on hepatic ischemia/reperfusion injury in rats[J]. J Surg Res, 2004,119:14- 20.

2013- 09- 04

2013- 11- 25

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260504)；江西省教育廳科研基金(GJJ12073)

*通信作者(correspondingauthor)： slyang@ncu.edu.cn

1001-6325(2014)08-1098-03

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