周 穎，張 輝，謝永紅，李曉超，沈 彥，尹端端

(秦皇島市第一醫(yī)院 1.病理科；2.科教科；3.腫瘤科， 河北 秦皇島 066000)

研究論文

HPV感染、HIF-1α及VEGF蛋白表達與非小細胞肺癌相關(guān)

周 穎1*，張 輝1，謝永紅2，李曉超1，沈 彥1，尹端端3

(秦皇島市第一醫(yī)院 1.病理科；2.科教科；3.腫瘤科， 河北 秦皇島 066000)

目的探討人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染在非小細胞肺癌(NSCLC)發(fā)生中的病因?qū)W意義，并初步分析HPV感染與低氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白表達之間的關(guān)系。方法用免疫組化法檢測60例NSCLC及20例肺良性病變組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達，用PCR法選用HPV16、18型特異性引物檢測兩組中HPV DNA的表達。結(jié)果1)NSCLC組HPV DNA積分吸光度比值為0.6046±0.0224，顯著高于肺良性病變組的0.0275±0.1230(P<0.05)。2)NSCLC組HIF-1α和VEGF蛋白的平均吸光度值分別為0.2548±0.0219和0.2051±0.0321，均顯著高于肺良性病變組(0.0826±0.0150和0.0726±0.0227)(P<0.05)。3)NSCLC中HIF-1α的表達率與VEGF呈正相關(guān)(P<0.05)。4) NSCLC中HPV(+)組VEGF的表達率為56.0%，顯著高于HPV(-)組的28.6%(P<0.05)。結(jié)論HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一；HPV感染可能通過上調(diào)VEGF的表達，促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。

非小細胞肺癌；人乳頭狀瘤病毒；低氧誘導因子-1α；血管內(nèi)皮生長因子

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種DNA病毒，感染人和動物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，越來越多的國內(nèi)外臨床和實驗室研究檢測出肺癌患者攜帶HPV[1- 2]，尤其是HPV 16和18型。但HPV感染與肺癌的關(guān)系，目前說法不一。低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，已有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過度表達。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管形成的中心調(diào)控因子，與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而肺癌中HIF-1α、VEGF與HPV感染的關(guān)系尚未見報道。本研究通過檢測非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)中HPV DNA、HIF-1α和VEGF蛋白的表達情況，探討HPV感染在NSCLC發(fā)生中的病因?qū)W意義，并初步分析NSCLC中HPV感染與HIF-1α、VEGF蛋白表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

收集秦皇島市第一醫(yī)院2012- 01—05 SCLC新鮮標本60例， 全部患者均已知情同意，其中男46例，女14例；年齡36～80歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；吸煙者43例，不吸煙者17例。20例肺良性病變組織，其中包括肺結(jié)核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴張1例。標本取材后，部分置-20 ℃保存，部分中性甲醛固定，石蠟包埋。

PCR引物均由北京奧科生物公司合成。免疫組化HIF-1α抗體和VEGF抗體及通用型SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)。

1.2 HPV PCR檢測

1.2.1 引物：選用分別用來擴增HPV16、18型的特異性引物2對及內(nèi)參GAPDH。引物序列如表1。

1.2.2 組織DNA的提?。喝∵m量凍存組織，加提取緩沖液制成單細胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復(fù)抽提3次，再經(jīng)100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)緩沖液溶解所得DNA，4 ℃保存。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度

1.2.3 PCR擴增反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系：每25 μL反應(yīng)體系中包含 10×緩沖液 2.5 μL，20 pmol/μL引物各0.5 μL，Taq酶1 μL(1 U/μL)，Mg2+1.5 μL，dNTPs 0.5 μL，去離子水16.5 μL及DNA模板2 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)特征為94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。每次實驗以不加模板為陰性對照，HPV16、18型分別用Siha和HeLa細胞系DNA作陽性對照。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，于紫外透射儀上觀察結(jié)果，繼用SQ9636 型掃描系統(tǒng)掃描。HPIAS-1000型圖像分析系統(tǒng)檢測各組目的基因及內(nèi)參的積分吸光度值(A),并以兩者比值作為各組HPV DNA的相對表達量。

1.3 免疫組化檢測HIF-1α和VEGF

1.3.1 方法：免疫組化染色步驟嚴格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1/100。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3.2 判斷標準：HIF-1α陽性表達為細胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，VEGF陽性表達為胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，顯色結(jié)果由兩位病理醫(yī)生采用半定量評分系統(tǒng)獨立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果：0分陰性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽性強度：1分弱表達(淺黃色)；2分中等強度表達(棕黃色)；3分強表達(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強陽性(++)。就其結(jié)果進行分析，將-、±合并為“-”，+、++合并為“+”，以簡化數(shù)據(jù)處理。同時用HPIAS-1000高清晰度圖像處理系統(tǒng),分析各組切片的免疫組化結(jié)果，用棕黃或棕褐色陽性顆粒的平均吸光度值(A)表示其HIF-1α、VEGF蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1HPVDNA的PCR檢測結(jié)果及與臨床病理特征的關(guān)系

M.marker；1,2.HPV16 positive,negative control；3,4.HPV16；5,6.HPV18 positive、negative control；7,8.HPV18圖1 PCR檢測HPV16、HPV18型DNA擴增結(jié)果電泳圖Fig 1 Electrophoresis of HPV16/18 DNA detected by PCR

NSCLC組HPV DNA積分吸光度比值為0.6046±0.0224，顯著高于肺良性病變組的0.0275±0.1230(P<0.05)(圖1)；NSCLC組HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關(guān)，而與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型 HPV DNA積分吸光度比值顯著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPV DNA積分吸光度比值顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)(表2)。

表2 NSCLC中HPV感染與臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

圖2 NSCLC中HIF-1α的陽性表達Fig 2 Positive expression of HIF-1α in NSCLC(×400)

2.2 HIF-1α、VEGF的檢測結(jié)果及兩者的相關(guān)性

NSCLC中HIF-1α的陽性表達位于細胞核(圖2)，平均吸光度值為0.2548±0.0219，顯著高于肺良性病變組的0.0826±0.0150(P<0.05)。VEGF的陽性表達位于胞質(zhì)(圖3)，平均吸光度值為0.2051±0.0321，顯著高于肺良性病變組的0.0726±0.0227(P<0.05)。NSCLC中HIF-1α(+)組VEGF的表達率為65.5%(19/29例)，明顯高于HIF-1α(-)組的16.1%(5/31例)，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者呈正相關(guān)(r=0.504,P<0.05)(表3)。

圖3 NSCLC中VEGF的陽性表達Fig 3 Positive expression of VEGF in NSCLC(×400)

HIF?1αnVEGFpositivenegativepositive2919(655%)10(345%)negative315(161%)?26(839%)?

*P<0.05 compared with positive group.

2.3NSCLC中HIF-1α、VEGF蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

HIF-1α表達與性別、年齡、吸煙和組織學分型無關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型HIF-1α蛋白平均吸光度值顯著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α蛋白平均吸光度值顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)(表4)。VEGF表達與性別、年齡、吸煙和組織學分型無關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型VEGF蛋白平均吸光度值顯著低于中和低分化型(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF蛋白平均吸光度值顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)(表5)。

2.4NSCLC中HPV感染與HIF-1α、VEGF表達的關(guān)系

NSCLC中HPV(+)組VEGF的表達率為56.0%(14/25例)，顯著高于HPV(-)組的28.6%(10/35例)(P<0.05)。 HPV(+)組與HPV(-)組間HIF-1α的陽性表達率分別為52.0%(13/25例)和45.7%(16/35例)，差異無統(tǒng)計學意義(表6)。HPV(+)、HIF-1α(+)組VEGF的表達率為69.2%(9/13例)，HPV(+)、HIF-1α(-)組VEGF的表達率為41.7% (5/12例)，兩組間無顯著性差異(χ2=1.924,P>0.05)。

表4 NSCLC中HIF-1α表達與臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

表5 NSCLC中VEGF表達與臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05 compared with well differentiation group;#P<0.05 compared with lymph node positive group.

表6 NSCLC中HPV感染與HIF-1α、VEGF表達的關(guān)系

*P<0.05 compared with positive group.

3 討論

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關(guān)系已經(jīng)引起人們的重視[3]。本研究證實，NSCLC組HPV DNA表達顯著高于肺良性病變組，提示HPV感染與NSCLC的發(fā)生有關(guān)，HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一。

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調(diào)節(jié)。缺氧是實體腫瘤微環(huán)境特征之一。細胞缺氧時，細胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進腫瘤的血管形成和腫瘤的發(fā)展，而且可反饋接受腫瘤生長過程中產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達，如此形成惡性循環(huán)促進腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[4- 6]。本研究中， NSCLC組HIF-1α蛋白表達顯著高于肺良性病變組，提示HIF-1α與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

VEGF是目前已知的作用最強的促血管生成因子，能刺激腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞增殖，促進微小靜脈通透性的增加，誘導血管形成。豐富的腫瘤新生血管必然會加速實體瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。近年來，肺癌中VEGF表達的研究報道較多，這些研究表明，VEGF在肺癌中高表達，其在肺癌中的表達與肺癌惡性程度、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)[7]。本研究中， NSCLC組VEGF蛋白表達顯著高于肺良性病變組，提示VEGF參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。VEGF是HIF-1α最重要的靶基因之一。組織缺氧時，HIF-1α不僅可以促進VEGF轉(zhuǎn)錄，還能增加VEGFmRNA穩(wěn)定性，從而上調(diào)VEGF表達[8]。大量文獻報道，VEGF和HIF-1α在許多腫瘤中被檢出，并發(fā)現(xiàn)HIF-1α升高的同時VEGF表達也上升。本研究顯示NSCLC中HIF-1α(+)組VEGF的表達率顯著高于HIF-1α(-)組，兩者呈正相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中，HPV(+)組VEGF的表達率顯著高于HPV(-)組，提示NSCLC中HPV感染可能上調(diào)VEGF表達。HPV(+)組與HPV(-)組間HIF-1α的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義，提示NSCLC中HIF-1α與HPV感染無相關(guān)性。本研究還顯示，NSCLC中HPV(+)、HIF-1α(+)組VEGF的表達率與HPV(+)、HIF-1α(-)組VEGF的表達率無顯著性差異。提示HPV感染的NSCLC中，其HIF-1α與VEGF的表達不存在相關(guān)性。說明NSCLC中HPV感染上調(diào)VEGF表達的這種作用不是通過HIF-1α來調(diào)節(jié)的，推測可能直接通過HPV16、18 E6蛋白發(fā)揮作用，HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠上調(diào)VEGF啟動子的活性[9]，促使VEGF表達增強，促進NSCLC發(fā)生發(fā)展。其具體機制有待進一步在體外細胞培養(yǎng)體系中進行驗證和分析。

NSCLC組中，HPV感染、VEGF表達均與性別、年齡、吸煙、組織學分型無關(guān)，而與組織分化程度相關(guān)?？赡苁怯捎诜只墒斓募毎顺隽思毎芷?，細胞不再具有分裂能力，細胞內(nèi)僅有少量病毒復(fù)制所需的復(fù)制酶。因此，高分化型HPV DNA表達低于中和低分化型，其上調(diào)VEGF的作用減弱，使VEGF蛋白的表達也低于中和低分化型。同時發(fā)現(xiàn)HPV感染和VEGF表達均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。推測HPV感染上調(diào)VEGF表達，而VEGF是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個重要指標，不僅誘導血管生成，還可誘導腫瘤外周形成新的淋巴管，促進癌細胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。提示HPV感染和VEGF表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起著協(xié)同作用。

綜上所述，HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一；HPV感染可能通過上調(diào)VEGF的表達，促進肺癌發(fā)生發(fā)展，并參與其浸潤、轉(zhuǎn)移。 因此選用HPV疫苗預(yù)防高危HPV感染及針對VEGF的抗血管治療將為NSCLC的預(yù)防和治療開辟新的途徑。

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Infection of HPV and its relationship withthe expression of HIF-1α and VEGF protein in non-small cell lung cancer

ZHOU Ying1*, ZHANG Hui1, XIE Yong-hong2, LI Xiao-chao1, SHEN Yan1, YIN Duan-duan3

(1.Dept. of Pathology; 2.Dept. of Science and Education;3.Dept. of Oncology, the First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066000, China)

ObjectiveTo investigate the etiological role of human papillomavirus(HPV) infection in the carcinogenesis of non-small cell lung cancer(NSCLC) and to discuss the possible relationship between HPV infection and HIF-1α,VEGF expression.MethodsBy using immunohistochemistry, the expressions of HIF-1α and VEGF protein were detected in 60 cases of NSCLC tissues and 20 cases of lung benign diseases tissues. PCR was employed to detect the expression of HPV16/18 DNA.Results1)The HPV DNA expression was 0.6046±0.0224 in NSCLC group which significantly higher than 0.0275±0.1230 in the benign diseases group (P<0.05). 2)The HIF-1α protein and VEGF protein expressions were 0.2548±0.0219 and 0.2051±0.0321 respectively in NSCLC, significantly higher than that in the benign diseases group (0.0826±0.0150 and 0.0726±0.0227) (P<0.05). 3)The expression rate of HIF-1α was significantly correlated with VEGF in NSCLC(P<0.05).4)The positive expression rate of VEGF was significantly higher in HPV DNA positive group (56.0%) than that in HPV DNA negative group(28.6%,P<0.05) in NSCLC.ConclusionsHPV infection may be one of the etiological factors in the carcinogenesis of NSCLC. HPV infection increases VEGF expression, promotes the occurrence and development of NSCLC.

non-small cell lung cancer; human papillomavirus; hypoxia inducible factor-1α; vascular endothelial growth factor

2014- 01- 09

2014- 03- 24

秦皇島市科技支撐計劃(2012023A135)

*通信作者(correspondingauthor)：zhouying8042254@sina.com

1001-6325(2014)08-1065-06

R 734.2

A

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聽力受損與老年人智力衰退有關(guān)

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)2013-02-04報道，聽力受損和智力衰退是兩種常見的老化癥狀，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，兩者之間可能有關(guān)聯(lián)。

70歲以上的老年人中，約有2/3有一定程度的聽力受損。在未來20年，患老年癡呆癥的人數(shù)預(yù)計將增加1倍，所以研究人員希望了解助聽器是否可以減緩老年人智力衰退。

領(lǐng)導這項研究的耳科醫(yī)生、流行病學家Frank R. Lin博士認為，在研究過程中，聽力衰退的年長者比聽力正常者更容易有記憶和思考問題。平均來說，有聽力問題的參與者智力明顯受損的時間，比那些沒有聽力問題的人提前3年。

這項針對近2 000名參加老化與健康研究的70～80歲年長者，在第5年做了聽力測試，并在接下來6年里進行了一系列的測試，評估記憶和思考能力的衰退情況。結(jié)果顯示，聽力受損的男、女衰退速度比聽力正常者快30%～40%；聽力受損的程度越大，心智功能衰退幅度越大。

雖然研究并未提出與老化有關(guān)的聽力受損是如何惡化記憶或思考問題，但Lin博士認為，有幾種說法：一種理論是未治療聽力受損的人，常與社會隔離，導致智力下降。之前的研究已鑒定出，孤獨是這些能力衰退的風險因子。另一個理論是，工作記憶受限于它可以容納和操作的信息量。內(nèi)耳的工作是接收聲音，并在傳到大腦譯碼之前準確的編碼，但這對于有聽力受損的人很難。如果大腦必須不斷消耗更多的資源來解碼聲音，可能為認知付出更多。

研究結(jié)果發(fā)表在美國醫(yī)學協(xié)會(JAMA)內(nèi)科期刊(JAMA Internal Medicine)網(wǎng)絡(luò)版。