曹美群，孫珂煥，吳安民，陳德珩，吳正治

(1.暨南大學 第二臨床醫(yī)學院 深圳市老年醫(yī)學研究所, 廣東 深圳 518020；2.深圳大學 第一附屬醫(yī)院， 廣東 深圳 518039)

研究論文

應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學方法篩選乳腺癌患者血清差異表達蛋白

曹美群1，孫珂煥1，吳安民1，陳德珩1，吳正治2*

(1.暨南大學 第二臨床醫(yī)學院 深圳市老年醫(yī)學研究所, 廣東 深圳 518020；2.深圳大學 第一附屬醫(yī)院， 廣東 深圳 518039)

目的篩選乳腺癌患者血清特異性表達蛋白，以尋找乳腺癌早期診斷的生物標志物。方法采集血清，提取蛋白，iTRAQ標記和ESI-QTOF-QⅡ質(zhì)譜檢測，再搜庫和Scaffold軟件分析，得到各組間血清差異表達蛋白。進一步采用Western blot驗證差異蛋白。結(jié)果血清中共鑒定出335個蛋白，達到嚴格定量標準的蛋白151個；乳腺癌與對照組間共篩選出23個差異表達蛋白；乳腺癌與乳腺纖維瘤組間篩選出8個差異蛋白。Western blot驗證Serotran-sferrin，Vitronectin，soform 1 of Gelsolin 3 個蛋白在各組中的表達結(jié)果與iTRAQ檢測結(jié)果一致。結(jié)論本研究證實iTRAQ-LC-MS/MS 技術(shù)能夠快速、有效地進行差異蛋白質(zhì)組學研究，并篩選到多個與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的血清蛋白，有可能作為乳腺癌早期診斷的生物標志。

乳腺癌；iTRAQ；蛋白質(zhì)組學；血清；生物標志物

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近年來，乳腺癌發(fā)病率在中國尤其是發(fā)達地區(qū)呈快速增長趨勢，已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首[1]。目前臨床上對乳腺癌早期診斷缺乏有效手段，血清蛋白質(zhì)組學的出現(xiàn)為尋找有效的臨床生物標志物提供了全新的方法。近年來同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術(shù)為解決低豐度蛋白的定性、定量研究提供了有效方法[2]。本研究應(yīng)用最新的蛋白質(zhì)組學定量方法iTRAQ標記法，探索乳腺癌患者的血清差異表達蛋白，尋找可能的生物標記,為乳腺癌早期診斷提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2008—2009年深圳市第二人民醫(yī)院年齡在30～55歲初次發(fā)現(xiàn)乳腺腫塊來就診并經(jīng)病理切片確診為浸潤性導(dǎo)管癌1期或2期患者45例，排除心腦血管和其他系統(tǒng)疾病以及精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在給予治療和手術(shù)前采血。隨機抽取20例分為乳腺癌1組和乳腺癌2組，用于iTRAQ-LC-MS/MS檢測。同時選擇年齡匹配的健康體檢者和乳腺纖維瘤患者各35例作為對照，排除心腦血管等系統(tǒng)疾病以及精神神經(jīng)系統(tǒng)疾病，兩組各隨機抽取10例用于iTRAQ-LC-MS/MS檢測。乳腺癌、乳腺纖維瘤和對照組各25例用于Western blot蛋白驗證。以上研究方案符合人體試驗倫理學標準，并得到倫理委員會批準，受試者在受試前知情同意并簽署知情同意書。

1.2 材料和設(shè)備

胰蛋白酶(Gibco公司)，2D Quant Kit和iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit(Applied Biosystems公司)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取消化：取血清用層析柱Genway Seppro-TM去除高豐度蛋白，加入TCA沉淀蛋白，蛋白定量后每組取100 μg進行還原烷基化，再加入丙酮沉淀蛋白，復(fù)溶后加入Trypsin酶解。

1.3.2 iTRAQ標記、HPLC分離肽段： 每組樣品對應(yīng)1個分子質(zhì)量(iTRAQ113-對照組，iTRAQ115-乳腺1組，iTRAQ117-乳腺癌2組，iTRAQ118-乳腺纖維瘤組)。將標記試劑加入異丙醇混勻后再加入對應(yīng)樣品液中反應(yīng)2 h；標記后各組肽段混合，加入緩沖液A,調(diào)整pH 3.0，用phenomenex SCX(200 ?,4.6 mm,250 mm)過柱分離。

1.3.3 MS/MS 鑒定：樣品經(jīng)Zip2tip微量層析柱脫鹽, 反相柱分離，ESI-QTOF-MS鑒定。數(shù)據(jù)用DATA ANALYSIS 4.0(Bruker)分析。結(jié)果經(jīng)MASCOTT 2.2搜庫，Scaffold軟件分析，變化倍數(shù)1.5倍以上為顯著差異。

1.3.4 Western blot驗證血清差異表達蛋白：提取蛋白，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，一抗和二抗孵育，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯像和數(shù)據(jù)收集。

1.4 統(tǒng)計學分析

SPSS11.5統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。

2 結(jié)果

2.1 血清蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果

共檢測到20596個肽段，去除重復(fù)冗余，共鑒定蛋白335個，達到定量標準的蛋白151個。

2.2 乳腺癌組與對照組之間血清差異表達蛋白

篩選到乳腺癌組與對照組間23個差異表達蛋白，包括2個表達上調(diào)蛋白和21個下調(diào)蛋白(表1),其中鑒定差異蛋白Isoform 1 of Gelsolin的一級和二級質(zhì)譜圖以及肽段的標記定量信息，見圖1。

表1 乳腺癌組與對照組之間血清差異表達蛋白Table 1 The differentially expressed proteins in serum between breast cancer and control groups

續(xù)表1

A.MS spectrum of Isoform 1 of Gelsolin； B.MS/MS spectrum of Isoform 1 of Gelsolin； C.MS/MS spectrum of a triply charged peptide ion (at m/z =752.94，+2H),which is originated from Isoform 1 of Gelsolin; D.quantitative information of Isoform 1 of Gelsolin.

圖1iTRAQ-LC-MS/MS鑒定蛋白Isoform1ofGelsolin的質(zhì)譜圖
Fig1ProteinidentificationandrelativequantificationusingiTRAQofIsoform1ofGelsolin

2.3乳腺癌組與乳腺纖維瘤組間血清差異表達蛋白

乳腺癌組與乳腺纖維瘤組之間篩選出8個差異蛋白(表2)。 其中Alpha-2-macroglobulin和Serotransferrin在兩個乳腺癌組均明顯高于對照組；Vitronectin在兩個乳腺癌組表達明顯低于對照組；Protein AMBP和Complement factor I在乳腺纖維瘤和乳腺癌組表達均低于對照組，但在乳腺纖維瘤組降低更為明顯，因此這些蛋白有可能作為區(qū)分乳腺腫塊良性和惡性的標志物。

2.4Westernblot驗證乳腺癌患者血清特異性表達蛋白

驗證結(jié)果證實，Isoform 1 of Gelsolin、Vitronectin在乳腺癌患者血清中的表達水平明顯低于對照組，而Serotransferrin在乳腺癌患者血清中的表達明顯高于對照組(圖2)，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。

3 討論

21世紀初，生命科學研究步入了后基因時代，其核心便是蛋白質(zhì)組研究。蛋白質(zhì)組學方法應(yīng)用于疾病研究，可以繪制蛋白質(zhì)圖譜，尋找疾病特異性蛋白標志物，并能提供治療藥物的候選靶點，為藥物研制和篩選提供依據(jù)。iTRAQ技術(shù)是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在2004年推出的一項新的同位素標記技術(shù)[2],為解決低豐度蛋白的定性、定量研究提供了有效的方法。本研究結(jié)果表明，iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)能夠快速、有效地進行差異蛋白質(zhì)組學研究。

本研究從乳腺癌組與對照組間篩選到23個血清差異表達蛋白，其中Alpha-2-macroglobulin和Serotransferrin在乳腺癌組表達明顯升高，另有 21個蛋白表達下調(diào)。該23個差異蛋白主要涉及機體的免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凝血功能及細胞黏附、遷移、增殖、分化和死亡等功能。其中Alpha-2-macroglobulin，Isoform 1 of Vitamin D-binding protein，Ceruloplasmin，Isoform 1 of Gelsolin，Pigment epithelium-derived factor，Serotransferrin，Vitronectin，zinc finger homeodomain 4，Isoform 1 of Fibronectin等蛋白已有相關(guān)研究顯示與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其結(jié)果與本研究一致[3- 4]。因此，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展主要與機體的免疫功能、細胞黏附、分化和死亡等機制相關(guān)，這些蛋白有可能成為乳腺癌早期診斷的候選標志物，值得進一步深入研究。

表2 乳腺癌組與乳腺纖維瘤組之間差異表達蛋白Table 2 The differentially expressed proteins in serum between breast cancer and breast fibroma groups

*P<0.05，**P<0.01 compared with control; #P<0.05，##P<0.01 compared with mammary fibroma圖2 Western blot驗證差異蛋白Fig 2 Protein expression in serum detected by Western blot

本研究同時從乳腺癌和乳腺纖維瘤之間篩查到8個差異表達蛋白，其中Alpha-2-macroglobulin是機體內(nèi)一種蛋白水解酶抑制劑,通過對蛋白水解酶的調(diào)節(jié), 發(fā)揮廣泛的病理生理效應(yīng),與機體免疫狀態(tài), 特別是與細胞免疫有直接關(guān)系，清除自由基和抑制自由基產(chǎn)生，抑制腫瘤生長, 阻止腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，在腫瘤方面的作用日益受到重視[5]。Serotransferrin作為腫瘤標志物, 其檢測可幫助某些腫瘤的輔助診斷已為人們所公認，腫瘤患者在轉(zhuǎn)鐵蛋白增多的同時其氧化狀態(tài)增強,轉(zhuǎn)鐵蛋白是鐵的運載蛋白, 鐵與之結(jié)合后束縛其參與自由基反應(yīng)的能力, 從而抑制過氧化程度[6]。Vitronectin是一種黏著糖蛋白，與細胞內(nèi)外多種蛋白相互作用，參與細胞黏附、組織入侵、 血管生成和轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程[7]。Isoform 1 of Elongator complex protein 4是一種RNA聚合酶，在染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白乙?；邪l(fā)揮著重要作用[8]。另外還有Keratin以及免疫蛋白因子Complement C5、Complement factor I和Protein AMBP 4個蛋白在組間表達差異均達1.5倍以上，但具體功能尚不清楚。這8個蛋白均可能為區(qū)分乳腺腫塊良、惡性的生物標志物。但由于本研究樣本量有限，結(jié)果需進一步大樣本驗證。

[1] 董曉民，鐘理，樊江平，等. 腫瘤標志物在乳腺癌診斷及預(yù)后中的應(yīng)用[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2012，32:960- 963.

[2] Ross PL, Huang YN, Marchese JN，etal. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[J]. Mol Cell Proteomics, 2004，3: 1154- 1169.

[3] Vergara D, Simeone P, Del Boccio P,etal. Comparative proteome profiling of breast tumor cell lines by gel electrophoresis and mass spectrometry reveals an epithelia mesenchymal transition associated protein signature[ J]. Mol Biosyst, 2012, 18: 3172- 3184.

[4] 魏曉麗, 王悅. 癌蛋白質(zhì)組學技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2008，28：1107- 1110.

[5] Rehman AA, Ahsan H, Khan FH. α-2-Macroglobulin: a physiological guardian[J]. J Cell Physiol, 2013,228:1665- 1675.

[6] Daniels TR，Bernabeu E．The transferrin receptor and the targeted delivery of therapeutic agents against cancer[J]． Biochimica et Biophysica Acta (BBA)， 2012，1820: 291- 317.

[7] Madsen CD，Sidenius N．The interaction betw een urokinase receptor and vitronectin in cell adhesion and signalling[J]. Eur J Cell Biol，2008，87: 617- 629.

[8] Chen C, Huang B, Eliasson M,etal. Elongator complex influences telomeric gene silencing and DNA damage response by its role in wobble uridine tRNA modification[J]. PLoS Genet, 2011,7:e1002258.doi:10.1371/journal.pgen.1002258.

Application of iTRAQ quantitative proteomicsin identification of serum biomarkers of breast cancer

CAO Mei-qun1, SUN Ke-huan1, WU An-min1, CHEN De-heng1, WU Zheng-zhi2*

(1.Shenzhen Geriatrics Research Institute, the 2nd Clinical Medical College of Jinan University, Shenzhen 518020;2.the First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhe 518039, China)

ObjectiveTo explore the presence of informative protein biomarkers of human serum proteome of breast cancer.MethodsSerum samples were profiled using iTRAQ technology coupled with LC-ESI-QTOF-MS, and Mascot searching. Western blot was used for validation of the candidate biomarkers.Results335 proteins were identified, and 23 proteins were associated with breast cancer. Three biomarker candidates generated from iTRAQ experiments were successfully verified using Western blot.ConclusionsThis result provides a global view of potential mechanisms and potentional biomarkers of breast cancer, and demonstrated that iTRAQ combined with LC-ESI-QTOF-MS quantitative proteomics is a powerful tool for biomarker discovery.

breast cancer; iTRAQ; proteomics; serum; biomarker

2013- 08- 09

2013- 11- 25

廣東省自然科學基金(9152408801000016);廣東省科技計劃(73124)

*通信作者(correspondingauthor)： szwzz001@163.com

1001-6325(2014)01-1054-05

R 737.9

A