王陵軍，高夢夕， 陳 潔， 孫敬和

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 國家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510405)

研究論文

心肌細(xì)胞自噬對心力衰竭大鼠心功能的影響

王陵軍*，高夢夕， 陳 潔， 孫敬和

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 國家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510405)

目的觀察心力衰竭時自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)以及抑制自噬對心力衰竭的影響，探討自噬在心力衰竭發(fā)病過程中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分為對照組(control)、心力衰竭組(HF)和3甲基腺嘌呤(3MA)組。心力衰竭組采用腹主動脈縮窄術(shù)制備大鼠心力衰竭動物模型。3MA組給予心力衰竭大鼠自噬特異性抑制劑3MA 15 mg/kg，連續(xù)兩周。采用心導(dǎo)管術(shù)檢測大鼠左室舒張末壓(LVEDP)、左室等容收縮期壓力上升最大速率+dp/dtmax、左室等容舒張期壓力下降的最大速率-dp/dtmax。用Western blot法檢測心肌組織自噬相關(guān)蛋白beclin-1、cathepsin D的表達(dá)。結(jié)果1)心力衰竭組LVEDP較對照組顯著增加(P<0.05)，±dp/dtmax較對照組顯著降低(P<0.05)。使用3MA組LVEDP較心力衰竭組顯著降低(P<0.01)，±dp/dtmax較心力衰竭組顯著增加(P<0.01，P<0.05)。2)心力衰竭組心肌組織自噬相關(guān)蛋白beclin-1和cathepsin D表達(dá)較對照組顯著增加(P<0.05)，而3MA組beclin-1、cathepsin D的表達(dá)較心力衰竭組顯著減少(P<0.05)。結(jié)論心肌細(xì)胞自噬在心力衰竭發(fā)病過程中發(fā)揮著致病作用。

自噬；心力衰竭；3甲基腺嘌呤； beclin-1; cathepsin D

心力衰竭在最近十幾年間發(fā)病率穩(wěn)步增加。最新數(shù)據(jù)顯示，在美國20歲以上大約有510萬人患有心力衰竭，每年有超過27萬人死于心力衰竭，預(yù)計(jì)到2030年，心力衰竭患者人數(shù)將增加25%[1]。在中國，成年人心力衰竭的患病率為0.9%，目前35～74歲成年人有420萬心力衰竭患者[2]，隨著中國人口的快速老齡化，心力衰竭的患病率還會顯著上升。心力衰竭將要成為中國心血管病領(lǐng)域的重要公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重地消耗著寶貴的衛(wèi)生資源。自噬是一個高度保守的由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器再循環(huán)的細(xì)胞機(jī)制。一直以來自噬被認(rèn)為是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制，是可以調(diào)節(jié)的，但近年的研究發(fā)現(xiàn)，不受控制的自噬活動被認(rèn)為是包括神經(jīng)變性功能紊亂[3]、癌癥[4]、感染性疾病[5]等疾病的發(fā)病機(jī)制，是調(diào)節(jié)失靈的表現(xiàn)。本研究旨在探索自噬在壓力負(fù)荷過重導(dǎo)致的心力衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級SD 雄性大鼠30只，體質(zhì)量270 ～ 300 g(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號0094274)。自噬相關(guān)蛋白beclin-1抗體(sc-10086)、cathepsin D(sc-6486)抗體及二抗(Santa Cruz公司),ECL plus(Bio-Rad公司)。

1.2 心力衰竭造模方法

參照本實(shí)驗(yàn)常用心力衰竭大鼠造模方法[6]。大鼠稱體質(zhì)量，給予100 g/L的水合氯醛3 mL/kg，麻醉后，暴露腹主動脈，并于雙側(cè)腎動脈上方鈍性分離腹主動脈，用4號縫合線將腹主動脈和與腹主動脈平行放置的外徑約0.6～0.9 mm的不銹鋼絲一并結(jié)扎，然后輕輕取出不銹鋼絲，使腹主動脈截面積縮窄至原來的25%～30%，造成腹主動脈狹窄，關(guān)腹。對照組鈍性分離腹主動脈后，縫合線僅繞于腹主動脈上，并不縮窄，術(shù)后3 d內(nèi)給予青霉素肌注(18 000 U/kg)，以預(yù)防感染。術(shù)后2周心臟彩超確診心力衰竭后納入實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

本研究分為對照組、心力衰竭組、3甲基腺嘌呤(3 methyladenine，3MA)組。對照組和心力衰竭組參照上述造模方法處理。3MA組在確診心力衰竭后腹腔注射自噬特異性抑制劑3MA，15 mg/kg，連續(xù)兩周。

1.4 大鼠心功能測定

大鼠頸部分離右頸總動脈, 插入充滿肝素0.9%氯化鈉注射液的導(dǎo)管,經(jīng)壓力轉(zhuǎn)換器接 RM600 四導(dǎo)生理記錄儀, 緩慢推進(jìn)同時觀察示波器,當(dāng)導(dǎo)管進(jìn)入左心室后停止推進(jìn), 測量左室舒張末壓(LVEDP)、左室等容收縮期壓力上升最大速率+dp/dtmax、左室等容舒張期壓力下降的最大速率-dp/dtmax。

1.5 自噬相關(guān)蛋白檢測

采用Western blot的方法，取大鼠心肌組織，組織勻漿裂解后，14 000 r/min離心5 min，4 ℃，取上清。提取大鼠心肌總蛋白后采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，采用5%牛血清白蛋白封閉1 h，TBST洗滌。一抗孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h, ECL plus顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，并分析目的蛋白凈光密度值。相對灰度值為目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值,表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能比較

心力衰竭組心功能指標(biāo)LVEDP較對照組顯著增加(P<0.05)，心肌收縮功能指標(biāo)+dp/dtmax和舒張功能指標(biāo)-dp/dtmax較對照組顯著降低(P<0.05)。3MA組LVEDP較心力衰竭組顯著降低(P<0.01)，+dp/dtmax和-dp/dtmax較心力衰竭組顯著增加(P<0.01，P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠LVEDP、±dp/dtmax的比較

*P<0.01 compared with control group;#P<0.05，##P<0.01 compared with heart failure group(1 mmHg=0.133 kPa).

2.2各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白beclin-1、cathepsinD表達(dá)的比較

心力衰竭組心肌組織beclin-1、cathepsin D表達(dá)較對照組顯著增加(P<0.01)，而3MA組beclin-1、cathepsin D的表達(dá)較心力衰竭組顯著減少(P<0.01)(圖1)。

3 討論

心力衰竭是多種病因引起心肌損害的最終結(jié)果，急性冠脈綜合征、冠狀動脈粥樣硬化和高血壓是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因。高血壓引起的心臟血液動力負(fù)擔(dān)過重是心力衰竭的一個重要原因。自噬是一個高度保守的由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器再循環(huán)的細(xì)胞機(jī)制。在自噬的過程中，要被降解的蛋白或細(xì)胞器將被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)雙層囊泡——自噬體中[7]。通過這些過程，自噬能通過提供酶解物維持細(xì)胞中間代謝以及清除細(xì)胞內(nèi)有毒或者受損的細(xì)胞或者細(xì)胞器，提高細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏下的生存能力。自噬能被細(xì)胞內(nèi)缺氧、饑餓、細(xì)胞內(nèi)壓力、應(yīng)激等誘導(dǎo)[8- 9]。但近年來，不受控制的自噬在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的作用開始受到重視。本研究表現(xiàn)，心力衰竭大鼠在心功能下降的同時，心肌組織自噬相關(guān)蛋白beclin-1和cathepsin D表達(dá)較對照組顯著增加，但在使用自噬特異性抑制劑3MA后，心力衰竭大鼠的心功能得到明顯改善，且自噬相關(guān)蛋白beclin-1和cathepsin D顯著降低，提示自噬在心力衰竭的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，采用自噬抑制劑可減輕心力衰竭心肌細(xì)胞自噬并改善心功能。因此，自噬可能成為心力衰竭治療的潛在靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)心力衰竭心肌細(xì)胞自噬是心力衰竭治療的新策略。調(diào)節(jié)心力衰竭時失控的心肌細(xì)胞自噬，可減輕心肌細(xì)胞因自噬導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡，這將有助于心力衰竭的治療。目前，對于心肌壓力負(fù)荷過重導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步研究。尋找一種能應(yīng)用于臨床具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬的藥物將可能有助于心力衰竭的治療。

A.representative Western blot detection of beclin-1 and cathepsin D in the myocardium from controls, HF and 3MA rats; B.quantitative analysis of beclin-1 and cathepsin D protein expression relative to β-actin; *P<0.01 compared with control group； #P<0.01 compared with heart failure group

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Effect of cardiomyocyte autophagicdeath on cardiac function in a rat model of heart failure

WANG Ling-jun*, GAO Meng-xi, CHEN Jie, SUN Jing-he

(the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine； the Laboratory of Chinese Internal Medicine,National Key Disciplines, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

ObjectiveTo investigate the pathogenic role of cardiomyocyte autophagic death in heart failure.MethodsThirty SD rats were randomized into three groups: control group, heart failure group and 3-methyladenine(3MA) group. In heart failure group, heart failure was induced by abdominal aorta constriction. The 3MA, a specific inhibitor on autophagy was used in a heart failure model of rats induced by overload pressure. We examined the heart function of rats in three groups. In addition, we analyzed the expression of autophagy associated protein, beclin-1 and cathepsin D in rat hearts using Western blot.ResultsThe expression of beclin-1 and cathepsin D in the hearts of heart failure rats were significantly increased as compared those in control group(P<0.05). 3MA significantly improved cardiac function and significantly downregulated the expression of beclin 1 and cathepsin D in abdominal aorta constriction-induced failing heart.ConclusionsAutophagic cardiomyocyte death plays an important role in the pathogenesis of heart failure in rats induced by pressure overload.

autophagy; heart failure; 3-methyladenine; beclin-1; cathepsin D

2013- 12- 26

2014- 03- 24

國家自然科學(xué)基金(81102585，81373570);廣東省自然科學(xué)基金(S2011040003510);中國博士后科學(xué)基金(20110490871)

*通信作者(correspondingauthor)：smu868@163.com

1001-6325(2014)08-1023-04

R 541.6

A