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        百會(huì)透懸厘針刺對(duì)腦出血模型大鼠腦組織NGF蛋白表達(dá)的影響*

        2014-11-26 00:55:40李雪巖李德韜付洪瑜牛霏霏孫忠人
        針灸臨床雜志 2014年9期
        關(guān)鍵詞:造模陽性細(xì)胞腦組織

        李雪巖,李德韜,付洪瑜,牛霏霏,孔 瑩△,孫忠人

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150001;2.大慶油田總醫(yī)院腦血管醫(yī)院,黑龍江大慶163000;3.黑龍江省康復(fù)醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150018;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院,河北廊坊065001;5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱150040)

        在臨床上應(yīng)用百會(huì)透懸厘針刺治療腦出血患者,收到較好療效,針刺可以激活腦細(xì)胞,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化,而真正起作用的是神經(jīng)生長因子(NGF),它有維持交感神經(jīng)的細(xì)胞的存在的作用,軸突的生長方向也需要它的參與,無論周圍神經(jīng)還是中樞神經(jīng)的修復(fù)也是離不開它的參與。作用機(jī)理是使Ca2+水平在細(xì)胞內(nèi)保持穩(wěn)定,使興奮性氨基酸的毒性得到有效的拮抗,另外能起到抗自由基的作用?,F(xiàn)在對(duì)腦出血的治療已從單純內(nèi)科治療轉(zhuǎn)為針對(duì)腦出血病理生理機(jī)制的治療,少針透刺是導(dǎo)師多年臨床經(jīng)驗(yàn)的心得。為了提供有效地理論支持,開辟新的治療途徑,特進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠,總重量(280±10)克,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供。

        1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

        ①307-6型臺(tái)式牙鉆機(jī)(中國上海齒科醫(yī)械廠);②立體定位儀ZH-藍(lán)星B型(中國安徽儀器廠);③生物組織包埋機(jī)KH-BL(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司);④微量注射器;⑤石蠟切片機(jī)LEICA RM 2135石(中國天津航空機(jī)電公司);⑥自動(dòng)脫水機(jī)XGQ-15/20(泰州世紀(jì)康峰機(jī)電制造有限公司);⑦展片機(jī)TEC-2601型(常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司);⑧烤片機(jī)PPTHK-21B(上海精密儀器儀表有限公司);⑨恒溫低溫冰箱;⑩電熱恒溫箱;?電子天平FA1004N(鄭州時(shí)代儀器設(shè)備有限公司);?病理圖像分析系統(tǒng)JD801(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司);?數(shù)碼相機(jī)(日本);?Motic image 3.2 圖像分析軟件(Motic公司生產(chǎn))。

        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

        ①PV-6001二步法免疫組化檢測(cè)試劑(北京中杉金橋生物有限);②NGF免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司);③DAB顯色試劑盒(天津百浩生物科技有限公司);④多聚賴氨酸(廣州市一科生物有限公司);⑤Na2HPO4·12H2O,分析純(北京康普匯維科技有限公司);⑥多聚甲醛,分析純(北京康普匯維科技有限公司);⑦NaCl,分析純(廣州市一科生物有限公司);⑧NaH2PO4·2H2O,分析純(北京康普匯維科技有限公司)。

        1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

        將80只健康雄性大鼠隨機(jī)取8只作為對(duì)照組,剩余72只造模成功后隨機(jī)分為模型組、藥物組、針刺組。藥物組與針刺于造模成功6 h后,給予相應(yīng)的藥物與針刺治療,然后在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)停止治療并取材。

        對(duì)照組(A):8只,不做手術(shù)處理,斷頭取材。

        模型組(B):24只,分為2天、7天、14天時(shí)間點(diǎn),每點(diǎn)8只大鼠,造模后2天、7天、14天分別取材。

        藥物組(C):24只,分為2天、7天、14天3個(gè)時(shí)間點(diǎn),每點(diǎn)8只大鼠。造模成功6 h后,給予腦活素稀釋液灌胃(按人:大鼠體重為200∶1配置)。2天組連續(xù)灌胃2天,1 ml每天1次;7天、14天同上,然后分別取材。

        針刺組(D):24只,分為2天、7天、14天3個(gè)時(shí)間點(diǎn),每點(diǎn)8只大鼠,造模成功6 h后,給予針刺治療,1次/天。針刺病灶側(cè)百會(huì)穴透懸厘穴,取穴方法參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》留針30 min,期間捻轉(zhuǎn)1次,每次1 min,以200轉(zhuǎn)/min速度捻針。針刺治療后于2天、7天、14天分別取材。

        1.5 腦出血模型的制備

        根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)尾殼核位置。采用腦內(nèi)定向注射膠原酶誘發(fā)大鼠ICH模型。將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,俯臥位固定于立體定位儀上,使上門齒鉤平面比耳間線平面低2.4 mm,這樣大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取頭皮正中,備皮消毒,正中切口,長度約1 cm,骨膜剝離器剝離骨膜,暴露前囟及冠狀縫,取前內(nèi)點(diǎn)(Bregma)右旁開3.5 mm、后0.2 mm定點(diǎn),用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔,深達(dá)硬腦膜表面,將微量注射器固定于立體定位儀上,沿鉆孔垂直進(jìn)針約6 mm,用自動(dòng)推進(jìn)器按每只 0.8 U(0.1 U/μL)膠原酶Ⅶ,以 1 μL/min的速度緩慢勻速注入右側(cè)尾狀核,緩慢出針。縫合頭皮,局部皮膚采用碘酚消毒,防止局部感染影響指標(biāo)觀察。

        1.6 標(biāo)本取材

        麻醉,暴露取材心臟,必須左心室插管最后抵達(dá)升主動(dòng)脈根部,于右心耳剪0.2 cm口做出口。將9%氯化鈉200 ml灌注,等到流出的變清澈,換100 ml的4%多聚甲醛灌注,等到標(biāo)本變硬。斷頭取腦,冠狀切片,厚度約5 mm部分標(biāo)本將其放入含有千分之一的DEPC的4%多聚甲醛1/0.1MPBS固定液中固定,然后按常規(guī)脫水、浸蠟、包埋制成厚度5 um的石蠟切片用于HE染色,NGF免疫組化檢測(cè)。

        1.7 NGF免疫組織化學(xué)檢測(cè)

        ①切片脫蠟;②放在30%H202溶液中孵育8 min,PBS洗5 min3次;③熱抗原修復(fù):將切片浸入0.01 mol/L,PH6.0構(gòu)椽酸鹽緩沖液中,加熱至95℃30 min,室溫冷卻30 min,PBS洗5 min;④滴加正常山羊血清封閉液30℃孵育30 min;⑤滴加一抗40℃孵育過夜;PBS洗5 min3次;⑥滴加入生物素化二抗工作液37℃孵育30 min,PBS洗5 min 3次;⑦DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒,取1 ml蒸餾水,加試劑盒中試劑各l滴,均勻后加至切片,室溫撇色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在8 min左右蒸餾水洗滌;⑧蘇木素復(fù)染,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀測(cè)。

        1.8 NGF陽性細(xì)胞表現(xiàn)

        血腫周圍腦組織中:在顯微鏡下觀測(cè),DAB顯色陽性細(xì)胞呈淡棕黃色或淡褐色,利用Motic image 3.2圖像采集系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析,在Motic-BA400倍顯微鏡視野下觀察。

        1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS17.0的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各實(shí)驗(yàn)組間的兩兩比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為有顯著差異,以P<0.01為有極顯著差異。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠腦組織中NGF檢測(cè)的陽性細(xì)胞數(shù)比較

        由表1可見,A組與B組比較均有意義。造模后2天,D組與B組比較有顯著性差異(P<0.01),D組和C組兩者結(jié)果有差異(P<0.05)。造模后7天、14天C組與 B組比較,NGF陽性細(xì)胞數(shù)增高(P<0.05),D組與B組相比,NGF陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高(P<0.01)D組和C組兩者結(jié)果有差異(P<0.05)。

        表1 各組大鼠NGF陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

        表1 各組大鼠NGF陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)

        注:與A 組比較,*P <0.05;與B 組比較,▲P <0.05,△P <0.01;與C組比較,●P<0.05。

        組別 n 2天 7天 14天空白組8 656.50 ±4.29 656.51 ±4.28 656.49 ±4.29模型組 24 700.30 ±4.01* 722.01 ±7.65* 741.50 ±8.51*西藥組 24 801.25 ±6.51 840.31 ±6.51 862.01 ±6.78▲針刺組 24 858.83 ±3.16△● 912.03 ±3.50△● 986.96 ±3.51△●

        2.2 大鼠腦組織NGF陽性細(xì)胞平均光密度值比較

        由表2可見,針刺組及西藥組周圍腦組織中NGF陽性細(xì)胞平均光密度值,隨不同的時(shí)相點(diǎn)變化而逐漸增加,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。針刺組與西藥組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

        表2 大鼠不同時(shí)相點(diǎn)周圍腦組織NGF陽性細(xì)胞平均光密度值的比較(±s)

        表2 大鼠不同時(shí)相點(diǎn)周圍腦組織NGF陽性細(xì)胞平均光密度值的比較(±s)

        注:與 B 組比較,*P <0.01;與 C 組比較,△P <0.01。

        組別 n 2天 7天 14天空白組8 0.31 ±0.01 0.31 ±0.004 0.31 ±0.004模型組 24 0.31 ±0.01 0.33 ±0.004 0.35 ±0.004西藥組 24 0.40 ±0.01* 0.42 ±0.01* 0.45 ±0.01*針刺組 24 0.48 ±0.01*△ 0.52 ±0.004*△ 0.58 ±0.004*△

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比研究表明:針刺治療效果優(yōu)于藥物治療組,而對(duì)于主要調(diào)控機(jī)理也是本實(shí)驗(yàn)的研究內(nèi)容。目前很多基礎(chǔ)研究證明氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)參與了腦出血的過程并使之加重,這一過程在很多的顱腦損傷中已經(jīng)被證實(shí)[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過頭穴透刺提高了NGF的表達(dá),而NGF可以提高損傷皮層內(nèi)的神經(jīng)元中超氧化物歧化酶以及谷膚甘膚還原酶的活性,因此,NGF有著重要的意義,在神經(jīng)修復(fù)這一復(fù)雜過程中起到了決定性的作用。

        另一方面,本實(shí)驗(yàn)中給予腦活素治療也提高了NGF的表達(dá),這說明營養(yǎng)腦細(xì)胞的藥物對(duì)于治療腦出血也有效,查閱相關(guān)文獻(xiàn)也提供了相似的結(jié)論,如王艷輝等[3]通過使神經(jīng)細(xì)胞凋亡,然后給予低劑量的可控制的來源于外部的NGF,經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究得出結(jié)論:濃度為100 ug/L的NGF可以有效的緩解與興奮性氨基酸毒性引起的腦細(xì)胞凋亡。此外蔡晶等[4]通過藥物干預(yù)對(duì)因血管病變而導(dǎo)致癡呆的模型大鼠皮質(zhì)相關(guān)區(qū)域神經(jīng)生長因子表達(dá)研究,觀察神經(jīng)細(xì)胞微結(jié)構(gòu)、傳遞信息的突觸使者數(shù)密度、NGF有效陽性指標(biāo)的神經(jīng)元光密度值等一系列手段證明:藥物可以提高NGF表達(dá),可以有效的促進(jìn)皮層相關(guān)神經(jīng)元中NGF的含量,能夠改善腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞的損傷。而刁士元[5]采用了新的模型建立方法,提高了造模的成功率,使顳葉缺血病灶更準(zhǔn)確,成功的建立了再灌注模型,然后給予一定量的來自自體以外的NGF,目的是觀察這一方法是否有效,通過一系列的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),來自外部的NGF有效地抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生,同時(shí)也降低了細(xì)胞的損傷,對(duì)已經(jīng)受損的神經(jīng)元細(xì)胞起到有效的修復(fù)作用。

        本實(shí)驗(yàn)證明透刺可以減少腦細(xì)胞的死亡、修復(fù)神經(jīng),而其內(nèi)在調(diào)控因子較多,NGF為其中之一。此外,也有學(xué)者提出NGF對(duì)腦細(xì)胞有修復(fù)作用,如石秋艷等[6]及鄒偉等[7]對(duì)腦組織內(nèi)的NGF以及相關(guān)因子的研究指出:在未手術(shù)組見少量陽性細(xì)胞出現(xiàn),而腦出血組隨著時(shí)間的推移而增長,說明NGF對(duì)腦細(xì)胞是有修復(fù)作用的。無論是外源性還是內(nèi)源性的NGF都對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞存在修復(fù)作用,同時(shí)它對(duì)軸突生長的方向,也起著重要的作用。而導(dǎo)師在臨床用本法治療腦出血患者,收到較好療效,故通過本實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步提供理論依據(jù)。針刺治療中風(fēng)病歷史悠久,在臨床實(shí)踐中更是效果突出。腦出血后通過少針透刺治療是未來的趨勢(shì),有待為本療法提供更多的臨床和基礎(chǔ)研究依據(jù)。

        通過本實(shí)驗(yàn)說明“百會(huì)透懸厘”針刺法能促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù);并修復(fù)在急性期腦出血中受損的細(xì)胞。

        [1]GuoZ,KindyMS,KrumanI,et al.AL S - linkedCu ZnrSOD mutation impairs cerebralsynaptic glucose and glutamate transport and exacer bates ischemic braininjury[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20:463-468

        [2]PhilipsMF,MattiassonCT,WielochT,et al.Neuroprotective and behav ioral efficacyof nerve growth factor transfected hippocam paI progenitor cell transplants afterexperimenta ltraumatic brain injury[J].J Neurosurg,2004,94(2):765 -774

        [3]王艷輝,趙冬寶,趙春玉,等.神經(jīng)生長因子對(duì)新生的大鼠小腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中國臨床康復(fù),2005,9(9):50-51

        [4]蔡晶,杜建,葛振華,等.康欣膠囊對(duì)血管性癡呆模型大鼠皮質(zhì)頂葉、海馬CA1區(qū)神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2005,25(2):157 -159

        [5]刁士元.神經(jīng)生長因子對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的影響[J].臨床神經(jīng)病雜志,2004,17(6):450 -451

        [6]石秋艷,何俊芳,孫惠芳,等.腦出血大鼠腦內(nèi)NGF和BDNF蛋白表達(dá)變化的研究[J].中國醫(yī)藥指南,2010(7):7

        [7]鄒偉,劉芳,孫曉偉,等.頭針對(duì)急性腦出血大鼠BDNF和NGF表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2010(6):13

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