楊國(guó)宏+張春軍+趙富生+孫曉冬+張靜+姚志文+李月珍+梁軍+劉志新

【摘要】 目的：探討自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素（EPO）對(duì)大鼠脊髓損傷（SCI）治療的效果。方法：培養(yǎng)與純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。80只SD大鼠制備脊髓損傷模型，隨機(jī)分為4組：干細(xì)胞移植組、EPO組、聯(lián)合組和對(duì)照組。采用BBB法進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分和組織切片觀察來(lái)評(píng)定修復(fù)情況。結(jié)果：三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均可明顯促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能和損傷后組織結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，其中聯(lián)合組效果更顯著。結(jié)論：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合EPO具有促進(jìn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)。

【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞； 促紅細(xì)胞生成素； 大鼠； 脊髓損傷； 修復(fù)

The Study on Autogeneic Esenchymal Stem Cells and Erythropoietin in Treatment of Spinal Cord Injury/YANG Guo-hong，ZHANG Chun-jun，ZHAO Fu-sheng，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：001-003

【Abstract】 Objective：To evaluate the effects of transplantation of autogeneic mesenchymal stem cells（MSCs） with erythropoietin（ EPO） therapy after rats spinal cord injury（SCI）.Method：MSCs were cultured and purified in vitro.The rat model with spinal cord injury was prepared by modified Allen method.Eighty rats were put into four groups：stem cell transplation group， EPO treatment group， combination group and control group.The motor function was evaluated with BBB score and the neurological function recovery was observed by HE staining.Result：Statistical differences were showed in inter-group（P<0.05）.Compared with control group，in practical group，the motor function and morphological recoverment was obviously in MSCs combined EPO group.Conclusion：The neurological function of rats with spinal cord can be obviously improved by autogeneic mesenchymal stem cells transplantation combined with EPO.

【Key words】 Mesenchymal stem cell； Erythropoietin； Rat； Spinal cord injury； Repair

First-authors address：Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.001

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，其致殘率和病死率均較高。目前，脊髓損傷在臨床治療后神經(jīng)功能的恢復(fù)效果不甚理想[1-5]，急需改進(jìn)，所以，脊髓損傷的治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[6-7]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有高度增殖和向多種細(xì)胞分化的潛能，可分化為對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)敏感且具有神經(jīng)電生理特性的細(xì)胞，還可以產(chǎn)生多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)受損的神經(jīng)纖維修復(fù)，移植后可促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[8]，而且可以自體移植，因此骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是治療脊髓損傷的理想種子細(xì)胞[9-10]。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種由腎臟產(chǎn)生的內(nèi)分泌激素，一直作為治療貧血的藥物而應(yīng)用于臨床。隨著人們對(duì)EPO研究的深入，EPO已被證實(shí)是一種新型的神經(jīng)保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)因子，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用[11]。本實(shí)驗(yàn)將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合應(yīng)用于脊髓損傷大鼠，探討骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和促紅細(xì)胞生成素聯(lián)合應(yīng)用是否有協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備 成年雄性SD大鼠80只，體重200～240 g；8周齡雄性SD大鼠4只，體重約100 g（均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供）。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林帕斯公司），低溫離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司），單人雙面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化）超純水凈化器（美國(guó)Millipore公司），DMEM培養(yǎng)基，Percoll分層液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立脊髓損傷模型與分組 8周齡的SD大鼠用于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化。成年SD大鼠水合氯醛麻醉后，俯臥位固定，找到T10棘突，向上和向下5 cm范圍內(nèi)進(jìn)行剪毛消毒。沿正中線切一3 cm長(zhǎng)的切口，暴露椎旁肌肉，用玻璃分針剝離肌肉，用骨鉗咬除棘突和椎板，形成方形骨窗，暴露T10脊髓，用脊髓損傷打擊器打擊制成SCI模型。造模的標(biāo)準(zhǔn)是：脊髓出現(xiàn)出血、水腫、后肢遲緩性癱瘓和尾巴痙攣性擺動(dòng)。沖洗切口后局部使用青霉素，以防感染，縫合后放回鼠籠喂養(yǎng)。按隨機(jī)的方式將80只SCI模型的大鼠分為對(duì)照組、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用組、促紅細(xì)胞生成素應(yīng)用組和聯(lián)合應(yīng)用組，每組20只。對(duì)照組每只鼠在脊髓損傷前1 d經(jīng)腹腔注射相同量的生理鹽水。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療組將每只鼠采取尾靜脈注射的方法在脊髓損傷后給予第3代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液1 mL（1×106個(gè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞）。促紅細(xì)胞生成素治療組的每只鼠在脊髓損傷前1 d經(jīng)腹腔按每千克體重5000單位給予促紅細(xì)胞生成素。聯(lián)合治療組每只鼠在脊髓損傷前1 d經(jīng)腹腔按每千克體重5000單位給予促紅細(xì)胞生成素，脊髓損傷后經(jīng)尾靜脈注射第3代培養(yǎng)的MSCs單細(xì)胞懸液1 mL（1×106個(gè)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞）。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) （1）大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評(píng)分：采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評(píng)分法 （全癱計(jì)0分，正常計(jì)21分）[4]。分別于術(shù)前1 d，術(shù)后第7、14、21、28天取大鼠置于地板上，待大鼠開始連續(xù)行走時(shí)，采用雙盲法觀察后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)的范圍和數(shù)量，根據(jù)雙下肢步態(tài)協(xié)調(diào)以及運(yùn)動(dòng)程度進(jìn)行評(píng)分，并記錄。每只觀察3～4 min，對(duì)各組鼠的雙側(cè)后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。（2）術(shù)后第1、28天行脊髓組織切片：分別將各組里5只大鼠麻醉后，在損傷脊髓處切取2個(gè)脊髓節(jié)段，將脊髓放入甲醛液中固定，放入冰箱過夜；取出脊髓置于含30%蔗糖的灌注液中至脊髓組織沉淀；然后進(jìn)行石蠟固定，切片后行HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差分析、獨(dú)立樣本比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 采用BBB評(píng)分法，術(shù)前大鼠BBB評(píng)分均為21分，SCI后為0分。從表中可以看出：對(duì)照組、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療組、促紅細(xì)胞生成素治療組和聯(lián)合治療組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能隨時(shí)間的變化而變化，表現(xiàn)為隨著造模時(shí)間的推移四個(gè)組大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能都是逐漸恢復(fù)，到第4周的時(shí)候每個(gè)組都有一定程度的恢復(fù)，與術(shù)前相比都有不同程度的改善。從手術(shù)后第7天起，四個(gè)組大鼠下肢功能存在明顯的差別，聯(lián)合組的分值最高，而對(duì)照組分值最低。術(shù)后7 d起，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療組、促紅細(xì)胞生成素治療組和聯(lián)合治療組神經(jīng)功能的BBB評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且聯(lián)合治療組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)明顯好于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療組和促紅細(xì)胞生成素治療組（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評(píng)分值 分

2.2 組織學(xué)變化 手術(shù)后1 d，對(duì)照組脊髓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，沒有腫脹等改變，細(xì)胞核大且圓，核仁清晰；其余三組脊髓組織內(nèi)有點(diǎn)狀或片狀出血區(qū)，一部分神經(jīng)元腫脹、空泡形成，核偏位，核仁較清晰。手術(shù)后28 d對(duì)照組脊髓組織內(nèi)部神經(jīng)元很少，有明顯的空洞出現(xiàn)且形成大量瘢痕組織；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療組與促紅細(xì)胞生成素治療組的脊髓組織局部出現(xiàn)空洞，有一些神經(jīng)元；聯(lián)合治療組脊髓組織內(nèi)空洞及瘢痕組織不明顯，內(nèi)含較多神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體清楚、突起較多。

3 討論

該試驗(yàn)中，筆者用BBB評(píng)分法對(duì)每只大鼠的神經(jīng)功能情況進(jìn)行評(píng)分，發(fā)現(xiàn)治療后的第7、14、21、28天，大鼠下肢的運(yùn)動(dòng)功能隨時(shí)間推移逐漸恢復(fù)，其中28 d時(shí)最為明顯。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在第7、14、21、28天相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EPO治療組與BMSCs治療組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合組比其余組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)更明顯，表明聯(lián)合組治療效果更好。SCI后，神經(jīng)纖維在損傷的部位開始發(fā)生變性，再向兩側(cè)發(fā)生變性，此過程持續(xù)兩到三周，其間纖維的變性和再生同時(shí)進(jìn)行，神經(jīng)功能的恢復(fù)不明顯。兩周起再生成為神經(jīng)纖維變化的主要形式，神經(jīng)功能的恢復(fù)開始明顯加快，實(shí)驗(yàn)中BBB評(píng)分的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)對(duì)照組大鼠盡管未接受治療，但雙后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分也逐漸增高，提示SCI后神經(jīng)有一定的自我修復(fù)能力。本實(shí)驗(yàn)治療后第28天，對(duì)照組脊髓組織內(nèi)部神經(jīng)元較少，有明顯的空洞出現(xiàn)且形成大量瘢痕組織，聯(lián)合治療組脊髓組織內(nèi)空洞及瘢痕組織不明顯，內(nèi)含較多神經(jīng)元，EPO治療組與BMSCs治療組介于兩者之間?？赡芘cEPO減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育以及BMSCs移植進(jìn)入損傷部位替代死亡的神經(jīng)細(xì)胞，吞噬壞死組織及癱痕，促進(jìn)軸突再生有關(guān)。BMSCs受脊髓損傷處微環(huán)境的誘導(dǎo)，可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[12-13]；并分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子[14]，有效地促進(jìn)軸突的再生，使受損傷的神經(jīng)纖維得以修復(fù)，對(duì)損傷脊髓內(nèi)的神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)作用，修復(fù)或促進(jìn)損傷局部生成新的血管和血管重建；同時(shí)還可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，提高神經(jīng)干細(xì)胞的分化率和存活率[15]。BMSCs可從患者自身提取，排除了細(xì)胞移植面臨的免疫排斥、細(xì)胞來(lái)源和倫理道德限制，因此，BMSCs被認(rèn)為是治療脊髓損傷的一種理想干細(xì)胞。研究表明，大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能表達(dá)EPO受體，當(dāng)EPO與該受體結(jié)合后，可以促使更多的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分裂，生成大量的子細(xì)胞[16]。此外，研究顯示EPO能動(dòng)員骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脊髓受損部位移動(dòng)，改善損傷部位的微環(huán)境，促進(jìn)移植的BMSCS在體內(nèi)存活及分化，從而分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，兩者共用具有協(xié)調(diào)作用[17]。本研究表明，聯(lián)合治療組大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)明顯好于其他實(shí)驗(yàn)組，能明顯促進(jìn)SCI后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，說(shuō)明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合EPO治療脊髓損傷，兩者具有協(xié)同效應(yīng)。這為臨床上應(yīng)用BMSCs聯(lián)合EPO治療SCI提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2014-07-11） （本文編輯：陳丹云）