王 瑩，陳 萍，王佳男，馮書章，郭學(xué)軍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130122）

金黃色葡萄球菌和沙門氏菌是我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中食品衛(wèi)生微生物常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，是常見食物中毒致病菌。在我國(guó)的細(xì)菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占四分之一，居于第四位，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位［1］。近年來，耐藥性沙門氏菌和金黃色葡萄球菌開始出現(xiàn)，并呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［2-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)病原菌耐藥性增長(zhǎng)率在全世界是最快的［4］。在畜禽上抗生素的大量使用或?yàn)E用，在抗生素選擇性壓力下，不僅會(huì)造成致病菌對(duì)抗菌類藥物耐藥性和交叉耐藥的產(chǎn)生，而且有研究表明抗生素治療可能會(huì)延長(zhǎng)感染動(dòng)物病情［5］。控制動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及傳播是解決人類日益嚴(yán)重耐藥性問題的重要環(huán)節(jié)。目前，左旋氧氟沙星（氟喹諾酮類抗生素）、頭孢類藥物（β-內(nèi)酰胺類抗生素）和慶大霉素（氨基糖苷類抗生素）是國(guó)內(nèi)臨床治療沙門氏菌或葡萄球菌感染的一線藥物，四環(huán)素（四環(huán)素類抗生素）為畜禽飼喂過程中常用藥物。

自2013年6月到2014年3月對(duì)吉林省長(zhǎng)春市超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中生鮮雞肉、豬肉進(jìn)行沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分離鑒定及耐藥性分析，以期為進(jìn)一步對(duì)食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和試劑 SC增菌液（20130918）、XLD培養(yǎng)基（20121107）、BS 培養(yǎng)基（20130516）、BP 培養(yǎng)基（20121126）、M-H 培養(yǎng)基（20120610）、蛋白胨（20120816），購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉（20111118）、磷酸氫二鈉（20130107）、氯化鈉（20120910），購(gòu)自北京化工廠；dNTPs、DNAMarker，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Taq酶（2000U）購(gòu)自長(zhǎng)春鼎國(guó)生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 抗生素 頭孢噻肟鈉（CefotaximeSodium，CEX）、左旋氧氟沙星（Levofloxacin，LVX）、慶大霉素（Gentamicin，GEN）、四環(huán)素（Tetracycline，TET），購(gòu)自長(zhǎng)春鼎國(guó)生物工程技術(shù)有限公司。其中慶大霉素含量為 694 μg／mg，其余抗生素含量均為＞900 μg／mg。

1.3 質(zhì)控菌株 大腸桿菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213），購(gòu)自吉林省檢驗(yàn)院。

1.4 金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的分離 分別按GB 4789.10-2010和GB 4789.4-2010從市售的豬肉、雞肉分離金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。

1.5 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的鑒定 采用PCR方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生化方法對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分離株進(jìn)行鑒定，使用引物invA對(duì)沙門氏菌進(jìn)行鑒定，引物nuc對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，引物序列見表1。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照 SN／T 1944—2007［6］制作藥敏紙片，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照 CLSI2010［7］對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌污染情況

按照國(guó)標(biāo)方法從樣品中分離金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，金黃色葡萄球菌總檢出率為46%（46／100），雞肉中檢出率為 44.29%（31／70）；豬肉中檢出率為 50%（15／30）。沙門氏菌總檢出率為16.84%（48／285），雞肉中檢出率為 21%（42／200）；豬肉中檢出率為7.06%（6／85），結(jié)果如表2所示。

表2 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分離情況

2.2 肉品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌耐藥率結(jié)果 利用K-B法檢測(cè)分離到的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌對(duì)4種抗生素的耐藥性。試驗(yàn)結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌對(duì)左旋氧氟沙星的耐藥率為56.52%（26／46）最為普遍，其次為四環(huán)素50%（23／46），對(duì)頭孢噻肟鈉耐藥率較低，為 8.7%（4／46）。所有菌株均對(duì)慶大霉素敏感，耐藥率為0。豬肉和雞肉中分離到的金黃色葡萄球菌均對(duì)頭孢噻肟鈉、左旋氧氟沙星和四環(huán)素具有耐藥性（表3）。雞肉中金黃色葡萄球菌菌株對(duì)四環(huán)素、左旋氧氟沙星的耐藥率高于50%，對(duì)頭孢噻肟鈉耐藥率為9.68%；豬肉中金黃色葡萄球菌菌株對(duì)四環(huán)素、左旋氧氟沙星均低于50%，對(duì)頭孢噻肟鈉耐藥率僅為6.67%。

表3 金黃色葡萄球菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)中分離到的48株沙門氏菌對(duì)各種抗生素的耐藥率在16.67%～87.5%之間。其中對(duì)四環(huán)素耐藥率最高，為87.5%（42／48）。沙門氏菌對(duì)四種抗生素總耐藥率依次為四環(huán)素（87.5%）＞慶大霉素（54.17%）＞頭孢噻肟鈉（25%）＞左旋氧氟沙星（16.67%）（表4）。雞肉中沙門氏菌菌株對(duì)四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率高于50%，對(duì)頭孢噻肟鈉和左旋氧氟沙星的耐藥率均低于30%；豬肉中沙門氏菌菌株四環(huán)素耐藥率高達(dá)100%，慶大霉素耐藥率為50%，對(duì)左旋氧氟沙星耐藥率為16.67%，對(duì)頭孢噻肟鈉敏感率為100%。

表4 沙門氏菌藥耐藥性檢測(cè)結(jié)果

2.3 肉品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌多重耐藥結(jié)果

2.3.1 金黃色葡萄球菌多重耐藥結(jié)果 金黃色葡萄球菌對(duì)4種抗生素共產(chǎn)生了6種耐藥譜。優(yōu)勢(shì)耐藥譜為L(zhǎng)VX、TET和LVX-TET譜型。大部分菌株具有耐藥性，分離株耐藥率達(dá)到78.26%，耐藥譜顯示金黃色葡萄球菌對(duì)四環(huán)素和左旋氧氟沙星耐藥較高。經(jīng)過多重耐藥分析發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌有10株對(duì)4種抗生素完全敏感，22株僅對(duì)其中的1種抗生素耐藥，14株對(duì)2種抗生素耐藥，2株對(duì)3種抗生素耐藥，多重耐藥率為4.35%（2／46）（表5）。

表5 金黃色葡萄球菌多重耐藥及耐藥譜結(jié)果

2.3.2 沙門氏菌多重耐藥結(jié)果 試驗(yàn)中分離到的48株沙門氏菌對(duì)4種抗生素產(chǎn)生9種耐藥譜，相對(duì)優(yōu)勢(shì)譜型為 GEN-TET、CEX-GEN-TET和CEXGEN-LVX-TET。本研究中沙門氏菌分離株耐藥率達(dá)到93.75%，29株（60.41%）對(duì)2種以上抗生素具有耐藥性，12株（25%）對(duì)至少3種抗生素具有耐藥性。沙門氏菌有3株對(duì)4種抗生素均敏感，16株僅對(duì)1種抗生素耐藥，17株對(duì)2種抗生素耐藥，7株對(duì)3種抗生素耐藥，5株對(duì)所用4種抗生素均有耐藥性（表6）。

表6 沙門氏菌多重耐藥及耐藥譜

3 討論

致病菌的污染會(huì)發(fā)生在處理、加工、包裝及分配各個(gè)環(huán)節(jié)中，雞肉分割期間腸道破裂，肉品銷售場(chǎng)所衛(wèi)生環(huán)境惡劣等均會(huì)導(dǎo)致污染。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，自2013年6月到2014年3月采集的豬肉和雞肉樣品中，金黃色葡萄球菌檢出率為46%，沙門氏菌檢出率為16.84%。于宏偉［8］等雞肉中金黃色葡萄球菌的檢出率為44.83%，豬肉中金黃色葡萄球菌的檢出率僅為19.77%。張芳［9］等報(bào)道2772份食品樣品中沙門氏菌在各類食品中的檢出率為9.15%。李秀桂［10］等對(duì)廣西生畜肉食源性沙門氏菌污染檢測(cè)分析結(jié)果為 12.5%～45.83%，生禽肉6.25%～31.25%。以上報(bào)道均表明我國(guó)的各類市售畜禽肉類均存在病原菌的污染現(xiàn)象。

近年來，耐藥性的出現(xiàn)及耐藥率的持續(xù)上升，給臨床預(yù)防和治療沙門氏菌感染帶來很大挑戰(zhàn)。本試驗(yàn)對(duì)獲得的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明金黃色葡萄球菌對(duì)氟喹諾酮類藥物和四環(huán)素類藥物的耐藥率偏高，分別達(dá)到56.25%和50%，對(duì)頭孢噻肟鈉耐藥率雖然相對(duì)較低，也應(yīng)對(duì)其給予重視；沙門氏菌對(duì)4種抗生素均呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，對(duì)四環(huán)素耐藥率達(dá)到87.5%。略低于王文俠［11］等報(bào)道的貴陽(yáng)市雞肉分離的沙門氏菌對(duì)頭孢噻肟鈉、氧氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素耐藥率，分別為 71.4%、42.9%、78.5%、100%；與吳云鳳［12］等報(bào)道結(jié)果相似?？傮w看來，本研究中來源于雞肉中的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌耐藥率高于來源于豬肉中的菌株。這可能是因?yàn)槲覈?guó)家禽規(guī)?；曫B(yǎng)較早，與抗生素長(zhǎng)期作為雞飼料添加劑被用于預(yù)防疾病和生長(zhǎng)促進(jìn)劑有關(guān)。細(xì)菌耐藥性多為獲得性耐藥，畜禽飼喂過程中抗生素的不合理使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。經(jīng)多次無抗生素壓力傳代，部分耐藥性會(huì)逐漸消失，所以在畜禽飼喂過程中應(yīng)合理使用抗生素，不宜持續(xù)使用同一類抗生素。

值得關(guān)注的是，試驗(yàn)中分離到的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均存在多重耐藥性。4.35%的金黃色葡萄球菌對(duì)3種抗生素具有耐藥性，25%的沙門氏菌對(duì)3種及3種以上抗生素具有耐藥性。國(guó)內(nèi)還有許多對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌多重耐藥性的報(bào)道。徐本錦［13］等報(bào)道金黃色葡萄球菌多重耐率達(dá)到88.52%。張秀麗［14］等對(duì)河南省生雞肉分離的沙門氏菌進(jìn)行耐藥研究，58.5%對(duì)3種以上抗生素具有耐藥性。鄒立扣［15］等對(duì)18株豬肉中分離的沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，27.78%對(duì)3種以上抗生素具有耐藥性?？梢?，國(guó)內(nèi)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌多重耐藥現(xiàn)象普遍。報(bào)道結(jié)果的不同可能是因?yàn)椴蓸訑?shù)量、采樣地區(qū)和所選用抗生素種類的差異造成的。隨著抗生素耐藥性的進(jìn)一步加劇，很多致病菌已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象。人一旦感染多重耐藥菌，臨床治愈難度會(huì)增大。

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