黃海斌，張許科，楊文濤，石少華，楊 軍，王 倩，趙 亮，王春鳳?，楊桂連?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，長春130118；2.普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽471000）

雞球蟲病是由艾美爾球蟲引起的一種寄生蟲病，它可以造成雛雞大量死亡、飼料利用率下降、生長緩慢等后果，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，據(jù)統(tǒng)計全世界每年用于防治球蟲病的費用達30億美元［1］。在感染雞的7種球蟲中E.tenella的致病性最強，主要侵害雛雞盲腸及其附近區(qū)域。雖然雞感染球蟲后，可產(chǎn)生特異性的循環(huán)抗體和粘膜分泌抗體，但在艾美爾球蟲的保護性免疫中，體液免疫對球蟲的免疫保護作用較弱，而細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在抗球蟲獲得性免疫中起主導(dǎo)作用［2］。成熟T細(xì)胞（CD3＋）分化的CD4和CD8亞群在抗球蟲的細(xì)胞免疫中具有重要作用，CD4細(xì)胞可以促進B細(xì)胞的成熟和分化，誘導(dǎo)CD8 T細(xì)胞活化，使之成為特異性CTL細(xì)胞。CD4細(xì)胞活化后可以分泌IFN－γ、IL－2和趨化因子等細(xì)胞因子，發(fā)揮抗球蟲作用。CD8細(xì)胞是最主要的殺傷性T細(xì)胞，它可以通過釋放穿孔素、顆粒酶或 Fas／FasL凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。本實驗通過利用E.tenella初次感染雛雞，檢測外周血中T細(xì)胞亞群及其增殖能力的動態(tài)變化，旨在探討E.tenella初次感染雛雞過程中細(xì)胞免疫機制，為雞球蟲病的免疫防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 1日齡肉雞購買于雙陽肉雞場，飼養(yǎng)于火焰消毒的雞籠中，飲水器、飼槽等器具均嚴(yán)格蒸煮消毒，飼料和飲水中不含有抗球蟲藥物。

1.2 蟲株 E.tenella孢子化卵囊，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲實驗室提供。蟲卵經(jīng)復(fù)壯、分離、純化、孢子化后置于2.5%重鉻酸鉀中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 鼠抗雞CD4－PE、鼠抗雞 CD3－FITC、鼠抗雞 CD8－PE（southernbiotech）等單克隆熒光抗體均購于艾美捷科技有限公司。FACS緩沖液、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、 磷 酸 鹽 緩 沖 液（Phosphate buffered saline，PBS），均購買于 BD Bioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液購買于 GE Healthcare Bio Sciences公司。Accuri C6流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；高速冷凍離心機購于德國Sigma公司。酶標(biāo)儀購于Thermo公司。

1.4 動物分組與處理 1日齡雛雞40只，飼養(yǎng)至11日齡，隨機分成2組：攻蟲組、空白對照組。攻蟲組雛雞于11日齡接種5×104個柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊，空白組接種相同劑量的PBS。分別于攻蟲后第2、7、12、16、20天每組隨機選取 6只雛雞，利用抗凝管每只雛雞采集1 mL血液，加等量PBS稀釋后備用。

1.5 雛雞血液淋巴細(xì)胞的分離 在10 mL離心管中先加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的血液2 mL沿管壁緩慢加入離心管中，2000 r／min水平離心20 min。將淋巴細(xì)胞層液體吸至離心管中，加5 mL PBS，混勻，2000 r／min 離心 5 min，棄上清。用 RPMI 1640（雙抗＋10%FCS），洗滌 1～2次，2000 r／min離心5 min，棄上清。 再用1 mL PBS懸浮細(xì)胞沉淀，混勻，血球計數(shù)板計數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測雛雞 CD4＋、CD8＋T 淋巴細(xì)胞將獲得淋巴細(xì)胞進行分管，分別設(shè)陰性對照管、CD4－PE、CD3－FITC 和 CD8－PE 單標(biāo)管。 每個樣品分2管，每管取1×106個細(xì)胞，加1 mL FACS緩沖液，4 ℃ 2000 r／min 離心 5 min，棄上清，加 100 μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞，每管加入10 μL對應(yīng)的抗體，4℃避光孵育1 h。加1 mL FACS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，4℃ 2000 r／min離心5 min，棄上清，沉淀用100 μL FACS緩沖液懸起，將細(xì)胞懸液過膜（70 μm），最后使用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀上機檢測。CD3＋CD4＋T淋巴細(xì)胞設(shè)門方法如圖1所示，CD3＋CD8＋T淋巴細(xì)胞按相同方法設(shè)門。

圖1 CD3＋CD4＋T淋巴細(xì)胞設(shè)門方法

1.7 MTS比色法檢測雛雞血液淋巴細(xì)胞增殖 實驗設(shè)置空白對照組（加RPMI 1640完全培養(yǎng)液）、對照組（加淋巴細(xì)胞懸液）和實驗組，每組設(shè)3個重復(fù)孔。取5×105個淋巴細(xì)胞置于96孔板中補加RPMI 1640 完全培養(yǎng)液至 190 μL，再加入 10 μL PHA（終濃度為 10 ug／mL），42 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h；然后加入 MTS，20 μL／孔；在 42 ℃ 5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀于490 nm波長檢測各孔吸光度（A）值，并計算刺激指數(shù)（SI）。

1.8 數(shù)據(jù)處理 利用 BD Accuri C6軟件、Graph?Prism5.0軟件和spss軟件進行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1 E.tenella 感染后雛雞外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T淋巴細(xì)胞亞群動態(tài)變化 11日齡雛雞初次感染 E.tenella 后第 2、7、12、16、20 天外周血中CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細(xì)胞在 CD3＋T 淋巴細(xì)胞中所占比例如圖2所示。結(jié)果顯示，攻蟲組雛雞外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細(xì)胞于感染后7～20 d明顯高于對照組雛雞（P＜0.05和P＜0.01），并且均于感染后第12 d達到峰值。

圖2 外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細(xì)胞亞群動態(tài)變化

2.2 E.tenella 感染后雛雞外周血中 CD4＋／CD8＋比值的動態(tài)變化 為評價感染E.tenella后雛雞免疫狀態(tài)和免疫平衡的變化，本實驗檢測了外周血中CD4＋／CD8＋比值的動態(tài)變化。雛雞外周血中CD4＋、CD8＋T 淋巴細(xì)胞比例和 CD4＋／CD8＋比值的動態(tài)變化見表1。11日齡雛雞外周血中CD4＋／CD8＋比值在初次感染E.tenella后第7 d開始明顯升高，于 16 日齡達到 1.78，20 d 時下降到 1.61。

表1 外周血中CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞比例和CD4＋／CD8＋比值的動態(tài)變化

2.3 E.tenella感染后雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖能力的動態(tài)變化 11日齡雛雞初次感染E.tenella后20 d內(nèi)，外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)于12～20 d明顯高于對照組雛雞（P＜0.05），并于感染后第 16 d達到峰值（圖3）。

圖3 外周血淋巴細(xì)胞增殖能力的動態(tài)變化

3 討 論

細(xì)胞免疫在抗球蟲免疫中發(fā)揮著重要作用，T細(xì)胞能識別不同的抗原而介導(dǎo)不同類型的細(xì)胞免疫效應(yīng)。CD3是T細(xì)胞的成熟標(biāo)志，它被認(rèn)為是T細(xì)胞發(fā)揮免疫作用的信號，并且在抗原識別過程中，CD3起著信號傳導(dǎo)的作用［4］。外周血中CD3＋T細(xì)胞主要由CD4＋和CD8＋T淋巴細(xì)胞組成。之前的研究中大多采用免疫組化法檢測腸道局部淋巴細(xì)胞亞群的變化，感染局部與各器官的免疫細(xì)胞通過循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)，通過檢測外周血中淋巴細(xì)胞亞群的變化可以更好的反映宿主的免疫狀態(tài)；并且應(yīng)用FCM可以簡單、準(zhǔn)確地檢測標(biāo)記CD分子的T淋巴細(xì)胞亞群動態(tài)變化。

本實驗結(jié)果顯示從感染后第7天開始雛雞外周血中 CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細(xì)胞明顯高于對照組，但是感染后第2天兩個細(xì)胞亞群與對照組相比并沒有明顯升高。這可能與球蟲的生活史有關(guān)，E.tenella孢子化卵囊進入腸道后48 h主要發(fā)生了卵囊釋放子孢子、子孢子侵入上皮細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)繁殖形成裂殖體這三個過程。在侵入過程中子孢子釋放蛋白可以刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)［5］，但是淋巴細(xì)胞的活化需要抗原遞呈等過程做前提，并且子孢子侵入細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)增殖，組織局部缺乏抗原的持續(xù)刺激，這些都能解釋為什么在感染后第2天雛雞外周血中T淋巴細(xì)胞并沒有明顯增多。

鄭明學(xué)等人通過ABC法檢測E.tenella感染后腸粘膜中T淋巴細(xì)胞的變化，發(fā)現(xiàn)腸粘膜中CD4＋、CD8＋T淋巴細(xì)胞分別于感染后第6天、第8天達到峰值［6］。 Rothwell的研究也顯示 E.maxima感染后3～5 d腸固有層中淋巴細(xì)胞達到峰值［7］。但是本實驗結(jié)果顯示在感染后第12 d外周血中CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T 淋巴細(xì)胞達到最高值，這可能與淋巴細(xì)胞的歸巢效應(yīng)有關(guān)?？乖贿M入機體就被吞噬細(xì)胞吞噬并運往外周淋巴結(jié)、脾臟或粘膜相關(guān)淋巴組織，在哪里被抗原遞呈細(xì)胞（APC）消化處理成抗原多肽并與細(xì)胞內(nèi)的MHCⅡ類分子結(jié)合形成Ag－MHC復(fù)合物，再經(jīng)遞呈、活化，成為效應(yīng)細(xì)胞。一部分效應(yīng)T細(xì)胞留在淋巴組織，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體；另一部分被活化的CD4＋T細(xì)胞進入循環(huán)系統(tǒng)，歸巢到抗原持續(xù)存在的盲腸周圍，使其發(fā)揮消除病原的作用［8］；研究發(fā)現(xiàn)抗原特異性CTL主要集中在受感染的盲腸組織內(nèi)，外周血中相對較少［9］。

在感染過程中機體良好的免疫功能要保持適度的反應(yīng)水平和維持動態(tài)平衡，CD4＋／CD8＋比值在臨床上作為免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)。正常情況下比值在1～2范圍內(nèi)變化，其值下降、升高可以反映機體處于免疫抑制或免疫增強狀態(tài)［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)雛雞初次感染 E.tenella 后外周血 CD4＋／CD8＋比值從第7天開始明顯升高，于第16天達到1.78，第20天時下降到1.61。結(jié)果提示，E.tenella初次感染能刺激免疫系統(tǒng)增強免疫反應(yīng)，對雛雞抗再次感染將發(fā)揮重要作用。大量球蟲感染可使機體免疫處于抑制狀態(tài)［11］，在本實驗檢測的20天內(nèi)并沒有觀察到明顯的免疫抑制反應(yīng)，這可能與檢測部位、攻毒劑量、寄生蟲毒力有關(guān)?，F(xiàn)已證明多種原蟲的感染能夠增強機體的抗病毒、抗腫瘤免疫反應(yīng)［12］，重組的E.tenella抗原也可以增強CD8＋T淋巴細(xì)胞的CTL 作用［13］。

本實驗結(jié)果顯示雛雞初次感染E.tenella后外周血T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)于感染后第12～20天明顯高于對照組雛雞，并于感染后第16天達到峰值，提示T淋巴細(xì)胞在抗球蟲免疫中具有重要作用。CD4＋T淋巴細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子（IFN－γ、IL－2、TNF 等）、誘導(dǎo) CD8＋T 細(xì)胞活化，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［14］。CD8＋T被抗原刺激后分化成CTL細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，CTL細(xì)胞主要生物學(xué)功能是消除宿主細(xì)胞內(nèi)感染和溶解細(xì)胞內(nèi)原蟲［15］。一部分活化的CD4＋、CD8＋T細(xì)胞成為記憶性T淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞可以通過循環(huán)系統(tǒng)到達外周免疫器官，在球蟲再次感染時迅速增殖并發(fā)揮抗球蟲作用。

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