何 斌，操繼躍，陳 潔，陸 征，李在建，楊文海，童新紅，江 暉

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢430070；2.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢430208）

舒巴坦匹酯（Sulbactam Pivoxyl）為 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑藥物，常以舒巴坦為原料，在其基礎(chǔ)上引入（2，2-二甲基-1-氧代丙氧）甲基而得的酯類化合物。在胃腸道吸收后進入血液循環(huán)系統(tǒng)，在血液中迅速轉(zhuǎn)化為舒巴坦而發(fā)揮抑酶作用［1-2］，與直接口灌舒巴坦相比，提高了其血藥濃度和生物利用度；舒巴坦通過與β-內(nèi)酰胺酶不可逆性結(jié)合而發(fā)揮對酶的抑制作用，保護β-內(nèi)酰胺類藥物對敏感細菌原有的抗菌活性。因此，臨床上常將其與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，對產(chǎn)酶耐藥菌發(fā)揮協(xié)同增效作用，提高耐藥菌的敏感性［3-4］。但是，目前國內(nèi)外未見舒巴坦匹酯及其相關(guān)物質(zhì)在家禽體內(nèi)藥動學(xué)的研究報道。因此，為了掌握其在家禽體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化及消除規(guī)律，為家禽養(yǎng)殖臨床用藥提供理論指導(dǎo)，開展其在肉雞體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究顯得十分必要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 美國Agilent 1100型高效液相色譜儀，紫外檢測器，Agilent ZORBAX SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；原料藥品均由四川華蜀動物藥業(yè)有限公司提供，舒巴坦鈉原料藥，批號：20100312，含量 98%；舒巴坦匹酯原料藥，批號：20100406，含量99%；舒巴坦對照品，上海安譜科學(xué)儀器有限公司提供，批號：CDCT-C 16986600，含量：99.0%。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 經(jīng)過反復(fù)試驗，確立色譜條件為如下：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長為 210 nm；流動相為乙腈：0.01 mol／L KH2PO4（pH 4.0） ＝ 7 ∶93；流速為1.0 mL／min；進樣量為20 μL；柱溫為（30±0.1） ℃。

1.2.2 血漿樣品處理 舒巴坦：準確吸取血漿0.5 mL，加入 1.0 mol／L HCl溶液 0.5 mL，旋渦振蕩1 min，然后加入3 mL乙醚提取兩次，每次旋渦振蕩1 min，3000 r／min離心，準確吸取乙醚層，合并兩次乙醚提取液于10 mL尖底聚丙烯離心管中，35℃水浴蒸干，殘留物加200 μL流動相充分溶解，12000 r／min 高速離心10 min，取上清20 μL 進樣分析，記錄色譜圖。

1.2.3 血漿標準曲線的建立 向9支5 mL聚丙烯離心管中各加入0.5 mL空白血漿，留一支作空白對照，然后依次加入對照品標準工作液，便得到藥物濃度依次為 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg／mL的血漿樣品。按照舒巴坦血漿樣品處理方法處理后，進樣分析。分別以測得舒巴坦的峰面積（A）為橫坐標，濃度（C）為縱坐標，建立標準曲線，求得舒巴坦的回歸方程為C＝ 0.0332A+0.0011，r為 0.9992。

1.2.4 方法學(xué)驗證 取空白血漿0.5 mL，分別添加適量舒巴坦標準工作液，濃度分別為 10、1.0、0.1 μg／mL的血漿樣品，按照血漿樣品的處理方法處理，并進行HPLC檢測，每個濃度設(shè)置5個平行，測定結(jié)果為日內(nèi)變異系數(shù)在5%以內(nèi)；重復(fù)檢測5 d，測定結(jié)果為日間變異系數(shù)在10%以內(nèi)。舒巴坦的萃取回收率為89.69%～96.33%；LOD、LOQ分別為 0.01、0.04 μg／mL。

1.2.5 藥物動力學(xué)試驗設(shè)計 試驗用三黃肉雞購于養(yǎng)雞場，35日齡，雌雄各半，試驗前適應(yīng)飼喂7 d，給藥前將20羽三黃肉雞隨機分成兩組，禁食12 h，采用單一兩期交叉試驗設(shè)計分別給藥。貴要靜脈注射和口灌兩種給藥方式，其中一組以含舒巴坦3.75 mg／kg.B.W（舒巴坦一般與阿莫西林等抗生素按照4：1聯(lián)合應(yīng)用，獸藥典規(guī)定阿莫西林的臨床使用劑量為15 mg／kg.B.W）劑量于貴要靜脈注射舒巴坦鈉注射液，另一組以1 mL／kg.B.W劑量口灌舒巴坦匹酯口灌液（舒巴坦的濃度為3.75 mg／mL），間隔10 d，交叉重復(fù)給藥。

貴要靜脈注射給藥后，剝離另一側(cè)貴要靜脈，分別于 0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8 h 采血1 mL左右；口灌給藥后，分別于 0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12 h 采血 2 mL 左右，置于已加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以3000 r／min離心15 min，取上清液于-20℃冷凍保存，待測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 方法學(xué)驗證考察數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析處理；藥時曲線圖和消除動態(tài)圖采用Excel軟件繪制；藥物動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算均采用3P97藥動學(xué)軟件分析，藥物動力學(xué)參數(shù)可根據(jù)公式進行計算。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 通過反復(fù)多次試驗所建立的色譜條件，基線平穩(wěn)，藥物峰形良好，樣品中阿莫西林及舒巴坦在各自的色譜條件下均能與雜質(zhì)峰良好分離。結(jié)果表明，本測定方法簡便，穩(wěn)定，分檢測效率高，色譜峰良好（圖1～圖3）。

圖1 空白血漿對照色譜圖

圖2 空白血漿添加舒巴坦色譜圖（1.0 μg／mL）

圖3 舒巴坦樣品色譜圖

2.2 藥物動力學(xué)數(shù)據(jù) 按照試驗設(shè)定方案進行給藥和樣品處理，經(jīng)高效液相色譜分析檢測、軟件分析計算。靜脈注射舒巴坦和口灌舒巴坦匹酯的藥物動力學(xué)參數(shù)見表1～表2。

靜脈注射舒巴坦鈉后，藥-時曲線符合無吸收二室開放模型，其藥-時方程為 C ＝6.4838e-7.6842t+3.9915e-0.7541t，口灌舒巴坦匹酯后，藥-時曲線符合有吸收一室開放模型，其藥-時方程為 C＝1.4554e-0.3392t-1.4554e-8.0039t。 根據(jù)兩者 AUC 得舒巴坦匹酯的生物利用度F為66.96%±5.95%。藥物在血漿中的藥-時曲線見圖4～圖5。

表1 靜脈注射舒巴坦鈉（3.75 mg／kg.B.W）在肉雞體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù) （n＝20）

表2 口灌舒巴坦匹酯 （3.75 mg／kg.B.W）在肉雞體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù) （n＝20）

圖4 舒巴坦鈉靜注給藥的血藥濃度-時間曲線

3 討論

圖5 舒巴坦匹酯口灌給藥的血藥濃度-時間曲線

本試驗中，建立了舒巴坦的高效液相色譜檢測方法，方法簡單、快速。舒巴坦具有很多活性基團，在液相色譜檢測時，藥物中的陽離子易與色譜柱中游離的硅羥基經(jīng)范德華力作用或發(fā)生離子反應(yīng)，使其在色譜柱中被吸附，洗脫時間延長，導(dǎo)致色譜峰拖尾。在進行分析時，選擇雙峰端C18硅膠色譜柱或者選擇洗脫能力較強的流動相均可以有效解決這種問題。本試驗比較了Agilent Extend-C18和Agilent ZORBAX SB-Aq兩種色譜分析柱的分析效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Extend-C18色譜柱的色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，色譜峰對稱性不符合分析要求，在流動相中添加乙酸胺、三乙胺防等防拖尾試劑，也不能抑制其拖尾。進行分析總結(jié)后發(fā)現(xiàn)Extend-C18色譜柱主要用于偏堿性藥物（pH 2～12）的分離，三乙胺主要抑制堿性藥物的色譜峰拖尾。最后采用ZORBAX SB-Aq色譜柱，適用于酸性條件下（pH 1～7）酸性藥物的分離，且適合高水相的流動相，可以走100%純水，符合本試驗流動相中95%的高水相的要求，色譜峰無拖尾現(xiàn)象，對稱性達0.9以上，舒巴坦的藥物峰與雜質(zhì)峰分離良好，有效的提高了檢測的靈敏度，使藥物與雜質(zhì)得到了有效分離。

目前未見舒巴坦在禽類相關(guān)藥物動力學(xué)方面的報道，相關(guān)動力學(xué)特征不好比較；本試驗測出舒巴坦匹酯在肉雞體內(nèi)的生物利用度為66.96%±5.95%，比舒巴坦鈉20%的生物利用度要高很多，這與楊永革［5］等報道的舒巴坦匹酯在人體內(nèi)的生物利用度80%要低一些，這可能是種屬的差異，主要是與禽類的消化道結(jié)構(gòu)功能有腺胃和肌胃，影響藥物吸收；以及禽類體溫較高，代謝較快等原因所致。

舒巴坦匹酯的藥動學(xué)數(shù)據(jù)表明，舒巴坦匹酯在肉雞體內(nèi)吸收迅速、分布快，與［6-8］研究報道的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物阿莫西林、氨芐西林等在肉雞體內(nèi)的消除半衰期和達峰時間較相近，顯示舒巴坦匹酯與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物阿莫西林、氨芐西林等［9-10］在肉雞體內(nèi)具有相似的藥動學(xué)特征，舒巴坦匹酯的藥動學(xué)研究，提供其在機體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化和排泄的規(guī)律，這對臨床藥劑量、給藥方案的擬定和舒巴坦匹酯與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物阿莫西林、氨芐西林等藥物的聯(lián)合使用具有重要的臨床指導(dǎo)意義。但舒巴坦匹酯與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物阿莫西林、氨芐西林等聯(lián)合應(yīng)用于肉雞的藥物動力學(xué)特征是否相似，有待進一步研究。

［1］郭志彩.β-內(nèi)酰胺類抗生素及其復(fù)合制劑的研究進展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，b（9）： 1289-1292.

［2］Lopeztt S， Alarcon T， Delgado T， et al.In vitro activity of βlactam agents and β-lactamase inhibitors in Clinical isolates of acinetobacter banmanni［J］.Veterinary Research Esp Quiioter，1999， 12（12）： 140-143.

［3］李小青，黃文祥.β-內(nèi)酰胺酶抑制劑研究進展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，（3）：356-357.

［4］Frere J M.Quantitative relationship between sensitivity to βlactam antibiotics and β-lactamases production gram-negative bacteria-I stead state treatments［J］.Biochem Pharmacol， 1989，38：1415-1426.

［5］楊永革，劉 靜，許雪廷.阿莫西林-舒巴坦匹酯片在健康人體的藥代動力學(xué)和相對生物利用度［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2007， （4）： 256-259.

［6］Escudero H， Raquel R，Mariona P， et al.Pharmacokinetics and residues of a new oral amoxicillin in Pigeon：A pre-liminary study［J］.Veterinary ， 2005， 15： 22-23.

［7］Dorrestein G M， Vangogh H， Rinzema J D， et al.Comparative study of ampicillin and amoxicillin after intravenous，intramuscular and oral administration in homing pigeons（Columba livia） ［J］.Research in Veterinary Science，1987，42：343-348.

［8］Esther H， Raquel R， Mariona P， et al.Pharmacokinetics and residues of a new oral amoxicillin for mulation in piglets：A preliminary study ［J］.Veterinary， 2005， 170： 237-242.

［9］Foroutan S M， Zarghib A， Shafaati A.Simultaneous determination of amoxicillin and cavulanic acid in human plasma by isocratic reversed-phase HPLC using UV detection［J］.Pharm Biomed Anal， 2007， 45（3）： 531.

［10］Carter G K，Martens R J，Brown S A，et al.Pharmacokinetics of sodium amoxicillin in foals after intramuscular administration ［J］.Veterinary Pharmacology and Therapeutics， 1986， 47（10）：2126-2129.