陳喜英，劉田福，郭永昌

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001;*通訊作者，E-mail:13603528575@163.com)

甘丙肽(galanin，GAL)是由29個(gè)氨基酸組成的羧基末端酰胺化的肽類(lèi)物質(zhì)，由Tatemoto等于1983年首次從豬小腸中檢測(cè)出來(lái)，廣泛分布在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中［1］。研究發(fā)現(xiàn)，它具有抑制葡萄糖介導(dǎo)的胰島素釋放，抑制脂肪組織中抵抗素基因的表達(dá)，促進(jìn)食欲，抑制胃腸蠕動(dòng)，提高垂體生長(zhǎng)激素、促黃體生成激素、催乳素釋放等功能，參與攝食、學(xué)習(xí)記憶、痛覺(jué)和神經(jīng)性損傷、修復(fù)與退行性變等一系列生物活動(dòng)［2－6］。

在正常的生理情況下，甘丙肽的表達(dá)量很低，而且大腦不同區(qū)域的甘丙肽與不同神經(jīng)遞質(zhì)組成復(fù)雜的功能系統(tǒng)［7－9］，但是由于研究技術(shù)受到限制，使得甘丙肽的生理病理功能的研究工作進(jìn)展緩慢。到目前為止，甘丙肽的具體功能和作用機(jī)制仍不十分清楚，因此，有待于新的甘丙肽研究工具推進(jìn)甘丙肽的研究步伐。本文以顯微注射的方法建立了甘丙肽過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為進(jìn)一步研究GAL在神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J小鼠，4－6周齡，40只;由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(晉2009－0001)。明周期7:30－19:30，暗周期19:30－7:30，溫度19－22℃。相對(duì)濕度:40%。自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 主要試劑和儀器

質(zhì)粒PUC18－PDGFβ－GAL(本實(shí)驗(yàn)室前期制備)，質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen公司);膠回收試劑盒(Qiagen公司);M2培養(yǎng)基，M16培養(yǎng)基，透明質(zhì)酸酶，礦物油(Sigma公司);孕馬血清(PMSG)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)(寧波激素制藥廠);Taq酶、內(nèi)切酶和鼠尾提取DNA試劑盒等(大連TAKARA公司);體視顯微鏡(Motic)、顯微注射儀，毛細(xì)玻璃管、精細(xì)鑷子(Dumont)等各種手術(shù)器械。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 轉(zhuǎn)基因片段的制備 質(zhì)粒提取(按質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行)，將所提取的質(zhì)粒用XbaⅠ和Hin dⅢ進(jìn)行雙酶切，37℃水浴4 h，后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收(按QIA quick Gel Extraction Kit進(jìn)行)，把膠回收的DNA溶液移入針頭式濾器中進(jìn)行純化，用TE緩沖液稀釋成3 ng/μl備用。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

1.3.2.1 取胚 以4－6周齡性成熟雌鼠為胚胎供體，腹腔注射PMSG和HCG進(jìn)行超數(shù)排卵，每只5 IU，后與種雄鼠合籠。次日，處死見(jiàn)栓小鼠，在解剖顯微鏡下將胚胎細(xì)胞撿出，置于覆蓋有石蠟油的M16微滴中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱暫時(shí)培養(yǎng)。

1.3.2.2 受精卵顯微注射 顯微注射于取胚當(dāng)日13:00左右開(kāi)始，把胚胎取出置于M2液滴中。將DNA溶液注射至雄性原核中，見(jiàn)到原核稍稍膨大即取針進(jìn)行下一枚卵的注射。注射后的胚胎重新移回新的M2液滴中，準(zhǔn)備移植。

1.3.2.3 胚胎移植 將形態(tài)良好的胚胎吸入移卵針細(xì)長(zhǎng)端，盡量將胚胎排列緊密以減少培養(yǎng)液的吸入量。采用輸卵管端口插入移植法，將含有胚胎的M2段吹入輸卵管。做完手術(shù)后，把它放入溫暖的環(huán)境中，蘇醒后5 h禁飲食，之后加精飼料喂養(yǎng)，待產(chǎn)。

1.3.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

1.3.3.1 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠 仔鼠出生后2周剪取約1 cm長(zhǎng)鼠尾，按鼠尾提取DNA試劑盒抽提基因組。以此基因組為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng)。在25 μl反應(yīng)體系中分別加入:ddH2O 8.6 μl，引物1 上游引物0.8 μl，下游引物 0.8 μl，引物 2 上游引物0.4 μl，下游引物 0.4 μl，Premix Taq 12.5 μl，DNA 1.5 μl。

所用引物序列為:引物 1上游引物:5’－CCCACCTCTCGCACTCTCC－3’，下游引物:5’－TTCTCCTTTGCAGGCATCCCA－3’;引物2上游引物:5’－TCTTAGCTCTGCTCTCCGGT－3’，下游引物:5’－CACTGGCTGAGGAAGGAGAC－3’。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物長(zhǎng)度 397 bp，體內(nèi)自身 GAL產(chǎn)物長(zhǎng)度196 bp。反應(yīng)條件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，60℃ 35 s，72℃ 35 s，38個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3.3.2 Western－blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠GAL表達(dá)通過(guò)組織勻漿分別提取甘丙肽首建鼠PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠的肝、腦組織蛋白，蛋白定量后，取100μg進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳分離蛋白，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶封閉液中室溫封閉1 h。加入新鮮一抗液(GAL一抗和GAPDH一抗稀釋度均為1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，回收一抗，PBST液洗膜3次，每次5 min。加入新鮮配制的二抗液(GAL二抗稀釋度為1∶3 000;GAPDH二抗稀釋度為1∶5 000)，室溫孵育1 h，棄二抗，PBST液洗膜3次，每次5 min，經(jīng)熒光化學(xué)發(fā)光成像儀曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒PUC18－PDGFβ－GAL的雙酶切鑒定

質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和Hin dⅢ進(jìn)行雙酶切后，骨架大小約為2 700 bp，目的片段 PDGF－GAL大小在3 000 bp左右(圖1)。測(cè)序結(jié)果與理論上的重組片段進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)到99%，并且在編碼區(qū)沒(méi)有出現(xiàn)堿基的突變。

圖1 重組質(zhì)粒PDGFβ-GAL的雙酶切電泳圖Figure 1 Electrophoresis of enzyme digestion of recombinant plasmid PDGFβ-GAL

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的整合鑒定

小鼠出生14 d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增GAL目的基因397 bp的片段來(lái)鑒定GAL轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型(見(jiàn)圖2)，共得到8只首建鼠，5只雄鼠和3只雌鼠，其中7只已傳代。

圖2 GAL過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定圖Figure 2 Identification of galanin-overexpression transgenic mice by PCR

2.3 GAL轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證外源性GAL在小鼠體內(nèi)的蛋白表達(dá)水平，我們?nèi)?只PCR鑒定陽(yáng)性的小鼠斷髓處死后解剖，同時(shí)取1只陰性小鼠作對(duì)照分別取肝、腦組織，勻漿處理后部分Western blot檢測(cè)GAL蛋白表達(dá)水平。F0代陽(yáng)性小鼠GAL在腦組織中表達(dá)水平明顯高于同窩陰性小鼠，而在肝組織中無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)腦、肝組織中GAL蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of GAL protein in brain and liver tissues by Western blot

3 討論

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是功能基因組時(shí)代醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究不可或缺的遺傳工程技術(shù)。自20世紀(jì)80年代初Palmiter等［10］開(kāi)創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的先河以來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)取得了很大進(jìn)展。在現(xiàn)行的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)中，顯微注射法最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛，并在多個(gè)物種均有成功報(bào)道的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)。

甘丙肽是近年來(lái)倍受研究者關(guān)注的一個(gè)基因，其功能是通過(guò)GAL受體GALR1、GALR2和GALR3中的一個(gè)或多個(gè)介導(dǎo)的，由此研究者從甘丙肽與其不同受體的相互作用著手，深入研究其與各種疾病的聯(lián)系。早期研究表明GAL參與促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，發(fā)育和再生，隨著免疫組化、原位雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷、缺血、老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)、抑郁癥(depression)等病人GAL及其受體的表達(dá)都明顯上調(diào)［11，12］。這些結(jié)果提示了GAL極有可能參與了神經(jīng)損傷反應(yīng)，神經(jīng)再生或修復(fù)等事件［13，14］。甘丙肽作為腦內(nèi)重要的神經(jīng)肽之一，已被證明不但參與許多神經(jīng)系統(tǒng)性疾病如癲癇等的重要功能活動(dòng)，還具有抗腫瘤作用［15，16］，在不同組織中甘丙肽的作用主要取決于其與GALR1－3中不同受體的作用，如在人垂體腺瘤中可同時(shí)檢測(cè)到甘丙肽及其受體GALR1和GALR2基因的mRNA，但是GALR3 mRNA僅出現(xiàn)在接受手術(shù)治療后又復(fù)發(fā)的病人的垂體腺瘤組織中，這項(xiàng)研究成果為垂體腺瘤病人的預(yù)后提供了重要依據(jù)［17］，有研究者明確提出甘丙肽受體對(duì)傷害性直覺(jué)，癲癇等生理病理方面有重要調(diào)節(jié)作用［18，19］，說(shuō)明不僅甘丙肽蛋白，其甘丙肽受體在不同疾病發(fā)生發(fā)展中也起著舉足輕重的作用。總而言之，甘丙肽及其相關(guān)蛋白在機(jī)體生理或病理狀態(tài)下的作用是廣泛而復(fù)雜的，至今仍成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

但由于機(jī)體自身甘丙肽的表達(dá)量少，使得研究工作一直進(jìn)展緩慢?；谥暗难芯繄?bào)道，我們以GAL為靶基因，成功構(gòu)建了PDGFβ-GAL目的片段，通過(guò)顯微注射技術(shù)成功建立了8只GAL過(guò)表達(dá)的的轉(zhuǎn)基因小鼠，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊設(shè)備，而且注射卵的成活率高，很大程度上提高了轉(zhuǎn)基因的效率。PCR技術(shù)能夠方便、快捷的檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因事件的發(fā)生，被廣泛用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)，但是當(dāng)目的基因拷貝數(shù)較低時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性［20］，而Southern雜交的方法對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR整合檢測(cè)可以起到互補(bǔ)作用。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵在于外源性蛋白的表達(dá)以及產(chǎn)生的蛋白是否具有生物學(xué)活性，因此我們進(jìn)一步通過(guò)Western blot的方法進(jìn)行了外源性GAL蛋白表達(dá)的檢測(cè)，研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠較同窩陰性對(duì)照高表達(dá)外源性GAL。綜上所述，通過(guò)顯微注射的方法構(gòu)建了GAL轉(zhuǎn)基因小鼠，并能穩(wěn)定傳代，即GAL過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平構(gòu)建成功。

我們?nèi)CR鑒定陽(yáng)性F0及同窩陰性對(duì)照的腦、肝組織分別提取組織蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，獲得了腦組織特異性高表達(dá)的GAL轉(zhuǎn)基因小鼠。這是因?yàn)楦时闹饕植荚谏窠?jīng)系統(tǒng)中，而我們構(gòu)建目的片段時(shí)使用的啟動(dòng)子PDGFβ鏈?zhǔn)窃谏窠?jīng)組織特異性表達(dá)的［21，22］，包括神經(jīng)元、樹(shù)突、部分軸突、腦的終端神經(jīng)和脊索的背根和靈長(zhǎng)類(lèi)的垂體后葉［23］，而且PDGFβ鏈啟動(dòng)子參與調(diào)控其下游基因在神經(jīng)組織特異表達(dá)［24，25］。因此我們所制備的轉(zhuǎn)基因小鼠同人類(lèi)的表達(dá)情況是相吻合的，這可以對(duì)以后GAL參與的疾病的治療預(yù)后研究中提供動(dòng)物模型。

［1］Tatemoto K，R kaeus A，Jornvall H，etal.Galanin—a novel biologically active peptide from porcine intestine［J］.FEBS Lett，1983，164(1):124－128.

［2］Jacobowitz DM，Kresse A ，Skofitsch G.Galanin in the brain:chemoarchitectonics and brain cartography a historical review［J］.Peptides，2004，25:433－464.

［3］Sporn MB，Roberts AB.Autocrine growth factors and cancer［J］.Nature，1985，313:745－747.

［4］Xu XJ，H kfelt T，Wiesenfeld-Hallin Z.Galanin and spinal pain mechanisms:where do we stand in 2008［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(12):1813－1819.

［5］Langel U，Bartfai T.Chemistry and moleular biology of galaninreceptor ligands［J］.Ann N Y Acad Sci，2004，863:86－93.

［6］Abramov U，F(xiàn)loren A，Eehevarria DJ，etal.Regulation of feeding by galanin［J］.Neuropeptides，2004，38(1):55－61.

［7］王雪岷，周長(zhǎng)滿(mǎn).甘丙肽和經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)在大鼠和家兔背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)共存的免疫組織化學(xué)研究［J］.解剖學(xué)報(bào)，1997，12(1):48－53.

［8］龐志平，李鑫.甘丙肽和經(jīng)典激素在大鼠垂體前葉細(xì)胞內(nèi)共存的研究—免疫組織化學(xué)方法［J］.解剖學(xué)報(bào)，1995，19(4):67－71.

［9］Botella BA，Delvaux M，Bueno L，etal.Intracellar pathways triggered by galanin to induce contraction of pig ileum smooth muscle cells［J］.J Physiol，1992，458:475－486.

［10］Palmiter RD，Brinster RL，Hammer RE.Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes［J］.Nature，1982，300(5893):611－615.

［11］Hwang IK，Yoo KY，Kim DS，etal.Expression and changes of galanin in neurons and microglia in the hippocampus after transient forebrain ischemia in gerbils［J］.Brain Res，2004，1023(2):193－199.

［12］Vrontakis ME.Galanin:a biologically active peptide［J］.Curr Drug Targets CNSNeurol Dis，2002，1(6):531－541.

［13］Shen PJ，Larm JA，Gundlach AL.Expression and plasticity of galanin systems in cortical neurons，oligodendrocyte progenitors and proliferative zones in normal brain and after spreading depression［J］.Eur JNeurosci，2003，18(6):1362－1376.

［14］Shen PJ，Yuan CG，Ma J，etal.Galanin in neuro(glio)genesis:expression of galanin and receptors by progenitor cells in vivo and in vitro and effects of galanin on neurosphere proliferation［J］.Neuropeptides，2005，39(3):201－205.

［15］Berger A，Santic R，Hauser Kronberger C，etal.Galanin and galanin receptors in human cancers［J］.Neuropeptides，2005，39(4):353－359.

［16］Tofighi R，Joseph B，Xia S，etal.Galanin decreases proliferation of PC12 cells and induces apoptosis via its subtype 2 receptor(GalR2)［J］.Proc Natl Acad Sci，2008，105(7):2717－2722.

［17］Tofighi R，Barde S，Palkovits M，etal.Galanin and its three receptors in human pituitaryadenoma［J］.Neuropeptides Cell，2012，46(5):195－201.

［18］Lemons LL，Wiley RG.Galanin receptor－expressing dorsal horn neurons:Role in nociception［J］.Neuropeptides，2011，45(6):377－383.

［19］Kapur J.Galanin receptors modulate seizures［J］.Epilepsy Curr，2011，39(8):207－211.

［20］楊繼山，潘慶杰，董曉.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12(3):45－49.

［21］Sasahara A，Kott JN，Sasahara M，etal.Platelet－derived growth factor B-chain-like immunoreactivity in the developing and adult rat brain［J］.Brain Res Dev Brain Res Cell，1992，68(1):41－53.

［22］Sasahara M，Sato H，Iihara K，etal.Expression of platelet－derived growth factor B－chain in the mature rat brain and pituitary gland［J］.Mol Brain Res，1995，32(1):63－74.

［23］杜靜，全雄志，趙海平.腦組織特異表達(dá)膽囊收縮素轉(zhuǎn)基因小鼠的建立［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，17(11):629－631.

［24］Sasahara M，F(xiàn)ries JWU，Raines EW，etal.PDGF B－chain in neurons of the central nervous system，posterior pituitary，and in a transgenic model［J］.Cell，1991，64(1):217－227.

［25］Games D，Adams D，Alessandrini R，etal.Alzheimer－type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F beta－amyloidprecursor protein［J］.Nature，1995，373(65):523－527.