王曉彥，武云霞

(1深圳市龍崗中心醫(yī)院耳鼻咽喉分院口腔科，深圳 518172;2山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院口腔科)

血管形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，實(shí)體瘤的生長需要血管提供氧氣和營養(yǎng)，沒有血管生成，原發(fā)腫瘤不會超過1－2 mm3［1］。近年來研究表明COX-2與多種腫瘤的部位及病理學(xué)分級無關(guān)，而與腫瘤的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，提示COX-2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中有重要的生理功能［2］，并參與實(shí)體腫瘤的血管生成［3，4］，但其機(jī)制尚不完全明確。本試驗(yàn)通過研究COX-2抑制劑尼美舒利 NIM(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)對人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞中COX-2、Ang-1基因表達(dá)的影響以探討其抗血管生成的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca－8113購自中科院上海細(xì)胞生物研究所，培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，0.25%的胰蛋白酶消化傳代，RNA抽提試劑盒W6221(上海華舜生物工程有限公司)，隨機(jī)引物、RNase抑制劑、dNTP AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA酶(均為 Fermentas公司)，COX-2、Ang-1和 GAPDH引物(上海生工生物工程公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 分組 Tca-8113對數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)量至1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后換液。NIM處理組濃度為25，50，100 和200 μmol/L;對照組含0.4%的等量二甲基亞砜。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，各組均重復(fù)3瓶。

1.2.2 RT-PCR檢測Ang-1基因的表達(dá) 按 RNA抽提試劑盒W6221說明書提取細(xì)胞總RNA，測定RNA純度并定量。cDNA過程為:總RNA 2μl、隨機(jī)引物1μl，DEPC水補(bǔ)至終體積12μl，混勻，離心3－5 s，70 ℃變性 5 min，冰上冷卻 3－5 min，離心3－5 s，冰上冷卻3－5 min，依次加入5倍緩沖液4 μl、RNase抑制劑 1 μl、10 mmol/L dNTP 混合液 2 μl，混勻，25℃溫浴5 min，加入 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，25 ℃10 min，42 ℃60 min，72 ℃10 min終止反應(yīng)后置于冰上。

PCR擴(kuò)增體系為10倍緩沖液2.5μl、25 mmol/L MgCl24μl、10mmol/L dNTP 混合液1μl、50μmol/L上下游引物(引物序列見表1)各0.5μl、cDNA模板10μl、TaqDNA 酶2μl、雙蒸水補(bǔ)終體積至 50 ml。10μl的PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠顯色，目的條帶用圖像分析系統(tǒng)作光密度測定，以COX-2、Ang-1光密度值分別與GAPDH光密度值之比值作為其mRNA相對含量。

表1 不同基因引物序列及大小Table 1 Gene primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

NIM各處理組與對照組之間COX-2、Ang-1 mRNA表達(dá)進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，見表2)。Tca-8113細(xì)胞經(jīng)過后可在Tca-8113細(xì)胞中檢測到COX-2和Ang-1 mRNA表達(dá)顯著下降(見圖1)。Pearson相關(guān)性顯示，COX-2 mRNA表達(dá)與NIM濃度之間有相關(guān)性(r=－0.963，P＜0.01)，Ang-1mRNA表達(dá)與NIM濃度之間也呈負(fù)相關(guān)(r=－0.988，P＜0.01)，表明 NIM 的抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。

表2 Tca-8113細(xì)胞中COX-2 mRNA和Ang-1 mRNA表達(dá)定量分析(±s，n=3)Table 2 Quantity analysis of expression of COX-2 mRNA and Ang-1 mRNA in Tca-8113 cells(±s，n=3)

表2 Tca-8113細(xì)胞中COX-2 mRNA和Ang-1 mRNA表達(dá)定量分析(±s，n=3)Table 2 Quantity analysis of expression of COX-2 mRNA and Ang-1 mRNA in Tca-8113 cells(±s，n=3)

與對照組比較，a F=151.778，a P＜0.01;與對照組比較，b F=232.384，b P＜0.01

NIM 50 μmol/L 0.577 9±0.026 5a 0.503 8±0.027 1b NIM 100 μmol/L 0.500 8±0.011 5a 0.322 4±0.018 0b NIM 200 μmol/L 0.290 8±0.021 4a 0.196 6±0.002 5b

圖1 Tca-8113細(xì)胞GAPDH、COX-2、Ang-1 mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果Figure 1 RT-PCR analysis results of GAPDH，COX-2 mRMA and Ang-1 mRNA

3 討論

自從1954年Algire提出腫瘤血管形成概念以來，人們就逐漸認(rèn)識到腫瘤是由腫瘤細(xì)胞和血管兩部分有機(jī)地組成。腫瘤條件下的血管生成是一持續(xù)、無控性的過程［5］。血管形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，腫瘤的血管生成是由促進(jìn)和抑制血管生成因子之間的不平衡造成的，在這些促進(jìn)血管生成的因子之中，目前研究得最多的就是血管生成素(angiogenins，Angs)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

血管生成素共有4名家族成員，分別為Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4，其中對 Ang-1和 Ang-2的研究比較多。Ang-1基因位于染色體8q22，是Tie-2的激活劑，主要由血管旁細(xì)胞包括周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)。Ang-1表達(dá)及其作用要晚于Ang-2及VEGF，Ang-1具有吸引血管周細(xì)胞和內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞聚集并相互作用，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接從而有利于維持血管壁完整，促進(jìn)血管重塑、穩(wěn)定血管、防止?jié)B漏的作用［6］。Wurmbach 等［7］用免疫組化檢測Ang-1/Tie-2在前列腺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tie-2表達(dá)于腫瘤性血管內(nèi)皮細(xì)胞，Ang-1表達(dá)于腺樣腫瘤細(xì)胞，瘤組織周圍大量血管生成，推測Ang-1/Tie-2以旁分泌的方式誘導(dǎo)癌組織的血管生成。有研究表明腫瘤中存在自分泌機(jī)制，即由腫瘤細(xì)胞分泌的Ang-1在以旁分泌方式促進(jìn)腫瘤血管生成的同時，還可能以自分泌方式作用于腫瘤細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響［8］。Park等［9］通過對早期肺癌切除的患者研究認(rèn)為，Ang-1血清水平可作為術(shù)后預(yù)后指標(biāo)。其促進(jìn)腫瘤血管生成的機(jī)制可能有以下幾個方面:①抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;②介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管旁細(xì)胞間的相互作用;③抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。

COX-2表達(dá)是口腔腫瘤發(fā)生的早期事件，提示其可能在口腔腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑能降低結(jié)腸癌的發(fā)病率，其機(jī)制主要是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、影響腫瘤新生血管生成等［11］。Fu 等［12］通過反義 COX-2 mRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)抑制COX-2的表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞增殖和遷移，治療胃癌過程中發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑在抑制腫瘤新生血管生成中起著重要作用。

在本研究中，人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞經(jīng)過不同濃度COX-2抑制劑NIM處理后，COX-2和Ang-1基因在細(xì)胞中表達(dá)明顯下降，且表達(dá)下降程度呈濃度依賴性，兩者下降呈正相關(guān)。這提示NIM可以抑制COX-2的活性，藥物濃度加大抑制程度增加，同時Ang-1基因表達(dá)也隨著藥物濃度增加被抑制程度增加。說明NIM是通過COX-2途徑下調(diào)Ang-1基因表達(dá)，推斷通過COX-2抑制劑阻斷COX-2表達(dá)可使得Ang-1基因表達(dá)降低，從而阻斷腫瘤血管的生成。

近年來，COX-2已成為一些腫瘤防治的新靶點(diǎn)。NIM可通過抑制COX-2來抑制腫瘤生成，因而其不僅可用于腫瘤的化學(xué)預(yù)防，還很有可能用于臨床治療。未來需要進(jìn)一步確定NIM用于人類口腔腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療的劑量、時間及適宜的人群，為預(yù)防頭頸部腫瘤發(fā)生及抗腫瘤治療提供切實(shí)可行的方案;其次，積極開發(fā)新的選擇性COX-2抑制劑，有望成為腫瘤的臨床治療的輔助手段之一。

［1］許國雄，陳偉良.環(huán)氧合酶－2及其抑制劑與頭頸腫瘤的關(guān)系［J］.國外醫(yī)學(xué):口腔醫(yī)學(xué)分冊，2004，31(1):23－26.

［2］Thiel A，Mrena J，Ristimki A.Cyclooxygenase－2 and gastric cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2011，30(3/4):387－395.

［3］Gallo O.Mlasini E，Bianchi B，etal.Prognostic significance of cyclooxygenase－2 pathway and angiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Hum Pathol，2002，33(7):708－714.

［4］Fujiwaki R，Jida K，Kanasaki H，etal.Cyclooxygenase－2 expression in endometrial cancer:correlation with microvessel count and expression of vascular endothelial growth factor and thymidine phosphorylase［J］.Hum Pathol，2002，33(2):213－219.

［5］劉敏，高文信，劉樹泰，等.金黃地鼠頰囊癌變過程中COX-2，VEGF表達(dá)及相互關(guān)系的研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2004，20(4):372－374.

［6］盧秀珍，畢宏生，崔彥.血管內(nèi)皮生長因子與促血管生成素1對大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用［J］.中國組織工程研究，2012，16(2):247－251.

［7］Wurmbach JH ，Hammerer P，Sevinc S，etal.The expression of angiopoietins and their receptor Tie－2 in human prostate carcinoma［J］.Anticancer Res，2000，20(6D):5217－5220.

［8］楊柳，歐希龍，顏芳，等.血管生成素－1在體外對人胃癌細(xì)胞生物學(xué)作用的研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，27(2):116－121.

［9］Park JH，Choi H，Kim YB，etal.Serum angiopoietin－1 as a prognostic marker in resected early stage lung cancer［J］.Lung Cancer，2009，66(3):359－364.

［10］Sudb J，Ristimki A，Sondresen JE，etal.Cyclooxygenase－2(COX-2)expression in high－risk premalignant oral lesions［J］.Oral Oncol，2003，39(5):497－505.

［11］Chell S，Kadi A，Williams AC，etal.Mediators of PGE2 synthesis and signalling downstream of COX-2 represent potential targets for the prevention/treatment of colorectal cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1766(1):104－119.

［12］Fu YG，Sung JJ，Wu KC，etal.Inhibition of gastric cancer－associated angiogenesis by antisense COX-2 transfectants［J］.Cancer Lett，2005，224(2):243－252.