劉茂林，樊林花，衛(wèi)兵艷

(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，太原 030001)

氟廣泛存在于地球上，是機體必需的微量元素之一，適量的氟有利于維持機體鈣磷代謝和保持神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)。但過多攝入可導(dǎo)致肝腎等多種組織器官的廣泛損傷［1，2］。前期實驗表明，過量氟化物導(dǎo)致大鼠肝細胞 DNA損傷，并可誘導(dǎo)細胞凋亡［3］，本研究觀察氟化物對 肝 組織 caspase-3、caspase-9基因表達水平，明確氟化物導(dǎo)致大鼠肝細胞DNA損傷并誘導(dǎo)細胞凋亡是否與caspase-3、caspase-9基因表達水平有關(guān)，進一步了解氟化物對肝組織損傷機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RNAiso Plus總RNA提取試劑(TaKaRa公司)、5×PrimeScript?RT Master Mix試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、反轉(zhuǎn)錄SYBRPremix?Ex TaqTMII試劑盒9(大連寶生物工程有限公司)、DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)、瓊脂粉(西班牙)、高速冷凍離心機3-18K(美國 Sigma公司)、PTC-200PCR儀(美國Bio-Rad公司)、ABI 7300全自動熒光定量PCR(美國ABI公司)、可調(diào)微量移液器(德國eppendorf公司)。

1.2 動物分組、肝系數(shù)測定及標本的采集

清潔級雄性SD大鼠48只，體重(100±10)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(晉)2009-0001。將SD大鼠觀察1周適應(yīng)環(huán)境后，隨機分為4組，每組12只，各組均飼喂大鼠正常飼料，對照組、低氟組、中氟組和高氟組分別自由飲用含0，50，100，200mg/L氟化鈉去離子水。動物飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境［SYXK(晉)2009-0001］，每月測定實驗動物體重，觀察體重變化，染毒120 d。染毒結(jié)束，稱量最后一次體重，麻醉后經(jīng)右心灌注生理鹽水，沖洗肝內(nèi)血液，快速對大鼠的肝組織進行取材，用濾紙吸干表面血液，稱重，測定肝系數(shù)［肝系數(shù)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%］。將肝組織迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備實時熒光定量PCR檢測。

1.3 肝組織中 caspase-3、caspase-9基因表達的實時熒光定量PCR檢測

稱取低溫凍結(jié)的肝組織100 mg加液氮研磨成粉末狀，按 RNAiso Plus試劑說明操作，提取總RNA，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行肝組織總RNA質(zhì)量鑒定，核酸分析儀測量其濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin作為內(nèi)參照，caspase-3上游引物:5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，下游引物:5’-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3’，產(chǎn)物長度147 bp;caspase-9上游引物:5’-CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA-3’，下游引物:5’-GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA-3’，產(chǎn)物長度176 bp;β-actin上游引物:5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’，下游引物:5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’，產(chǎn)物長度115 bp。然后進行擴增:95 ℃ 30 s;然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，添加溶解曲線，反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動輸出溶解曲線及對應(yīng)Q值(達到閾值循環(huán)數(shù))和擴增曲線。取6μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖進行凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察，以進行PCR產(chǎn)物鑒定。

1.4 實驗數(shù)據(jù)處理及分析

相對表達量比較采用2-ΔΔCt法分析，表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數(shù)。ΔCt(染氟組)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因);ΔCt(對照組)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因);ΔΔCt=ΔCt(染氟組)-ΔCt(對照組)。目的基因的相對表達水平=2-ΔΔCt。

樣品的閾值線設(shè)置相同，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件計算重復(fù)樣品間Ct均值及標準偏差，應(yīng)用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同染氟時期大鼠的體重變化

從表1可知，染氟過程中各組大鼠生長發(fā)育良好，體重均明顯增加。經(jīng)統(tǒng)計分析，不同時期各染氟組體重與相應(yīng)的對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各染氟組之間體重兩兩比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 氟對各組大鼠肝臟臟器系數(shù)的影響

從表2可知，染氟組大鼠肝臟臟器系數(shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;各染氟組間比較差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同染氟時期大鼠的體重變化(±s，g)Table 1 Changes of body weight of rats exposure to different concentrations of fluoride for different time(±s，g)

表1 不同染氟時期大鼠的體重變化(±s，g)Table 1 Changes of body weight of rats exposure to different concentrations of fluoride for different time(±s，g)

各染氟組與對照組比較，P＞0.05

中劑量組 12 104.0±9.9 204.4±25.8 294.4±27.5 340.8±53.7 453.7±37.6高劑量組 12 105.6±9.1 209.9±19.4 283.6±40.5 366.3±23.7 400.2±35.5

表2 各組染氟120 d大鼠肝臟臟器系數(shù)Table 2 Comparison of liver coefficient after exposure to different concentrations of fluoride for 120 d

2.3 肝臟組織總RNA的濃度和純度

大鼠肝臟RNA經(jīng)提取純化后，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行快速分析(15 V/cm)，從圖可以看出，總RNA有明顯三條帶(5S，18S和28S)，表明總RNA的完整性較好，基本無降解。SD大鼠肝組織總 RNA，吸光度 A260/A280均在 1.8-2.0 之間，表明總RNA的純度達到了實驗要求(見圖1)。

圖1 總RNA電泳圖Figure 1 Total RNA electrophoresis of rat liver tissues after exposure to different concentrations of fluoride

2.4 樣品擴增動力學(xué)曲線和溶解曲線分析

實驗組與對照組SYBR GreenⅠ熒光定量PCR溶解曲線所得的caspase-3、caspase-9擴增時的Tm值非常均勻，并且峰值單一(見圖2)，說明沒有引物二聚體和非特異性條帶形成。由擴增曲線看出擴增曲線間距非常均一，平行性較好(見圖2)，說明目的基因與內(nèi)參基因擴增效率一致，符合在不制作標準曲線的情況下進行相對定量的條件。

2.5 目的基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠水平電泳檢測

目的基因 PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳得caspase-3、caspase-9、β-actin 片段分別為 147 bp、176 bp、115 bp，確定為所需要的目的基因(見圖3)。

2.6 氟對大鼠肝臟caspase-3基因和caspase-9基因表達的影響

相對定量分析表明，氟誘導(dǎo)大鼠肝臟細胞損傷，引起了caspase-3和caspase-9基因表達水平的改變(見表3)，低、中、高劑量組caspase-3基因表達量分別是對照組的0.34±0.10、1.37±0.43 和2.27±0.73倍，其中高氟組表達顯著增高(P＜0.05);caspase-9的基因表達量分別是對照組的1.03±0.36、3.05±0.68 和 5.85±0.52倍，中氟組和高氟組表達顯著高于對照組(P＜0.05)。

3 討論

caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，其家族成員大部分是凋亡的啟動子或效應(yīng)子，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［4］。目前研究者發(fā)現(xiàn)的有15種caspase，根據(jù)caspase在級聯(lián)反應(yīng)的上、下游所處位置和其功能的不同，把它分為三大類，第一類為凋亡始動子，它位于級聯(lián)反應(yīng)的上游，它們是包括caspase-2、caspase-8、caspase-9 等，能在其他蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游的caspase。第二類是凋亡效應(yīng)子，它位于級聯(lián)反應(yīng)的下游，分別是caspase-3、caspase-6、caspase-7，它們能被上游的始動子激活，而激活后的caspase作用于那些特異性底物上，使細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)及生化等改變，最終導(dǎo)致細胞凋亡等其他改變。第三類包括caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-13、caspase-14，此類 caspase 在細胞因子介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著主要作用，其次還在死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑中起到輔助作用［5］。

圖2 β-actin、caspase-3、caspase-9熒光定量PCR擴增曲線(左)和溶解曲線(右)Fig 2 Amplification curve(left)and dissolution curve(right)of fluorescence quantitative PCR for the β-actin，caspase-3 and caspase-9

圖3 RT-PCR產(chǎn)物檢測Figure 3 RT-PCR product of caspase-3 and caspase-9

有研究表明，caspase酶原可以通過以下幾種方式激活:自活化(autoactivation)、轉(zhuǎn)活化(transactivation)和非caspase蛋白酶活化(activation by noncaspase proteinases);caspase酶原在某種條件下有自活化的潛能，比如這種酶原在高濃度時可以自活化［5］，把 caspase-2的原域和 caspase-3酶原融合起來，大大增強了酶原的自活化和caspase-3誘導(dǎo)的凋亡［6，7］。caspase-9 能激活酶原 caspase-3 和 caspase-7，但不能激活caspase-6，caspase-3反過來可以再激活 caspase-9 及 caspase-8，這樣形成正反饋［8］，即活化的 caspase-9 激活 caspase-3［9］和 caspase-7，活化的caspase-3反過來又能激活caspase-9酶原，形成正反饋通路。

本實驗采用實時熒光定量PCR技術(shù)對肝組織caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，氟誘導(dǎo)大鼠肝臟細胞凋亡以及對肝細胞DNA損傷的同時，引起了caspase-3和caspase-9 mRNA表達水平的增高，低劑量的氟對caspase-3 mRNA表達量較caspase-9 mRNA影響不顯著，中、高劑量的氟對caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達影響均很明顯，呈上升趨勢，特別是中、高劑量組的caspase-9 mRNA表達量分別是對照組的3.05±0.68、5.85±0.52倍。通過檢測大鼠體重及肝臟臟器系數(shù)，染氟組與對照組相比，體重及肝臟臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明氟對體重及臟器系數(shù)無明顯影響，可能是因為大鼠首次接觸外來物質(zhì)需要一個適應(yīng)過程，氟在該過程中對機體體重及臟器系數(shù)的影響可能未顯示出來。

綜上所述，氟引起的 caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達較對照組增高，高劑量組caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達較中劑量組增高，中、高劑量的氟對 caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達影響更大。根據(jù)以上實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，低劑量氟進入大鼠肝組織內(nèi)后，并不一定能立刻激活caspase-9，隨著氟劑量的增大和染氟時間的延長，氟有可能引起一系列肝組織細胞因子的改變，激活caspase-9，進而激活caspase-3最終導(dǎo)致肝組織細胞的損傷。由此推測氟對肝細胞DNA損傷以及誘導(dǎo)細胞的凋亡，可能是通過激活caspase-3和caspase-9而促進了細胞DNA損傷和凋亡的發(fā)生，當然，氟對大鼠肝組織的損傷作用及機制復(fù)雜，還有待更進一步探索。

表3 不同染氟劑量大鼠肝組織caspase-3和caspase-9基因表達變化Table 3 Expression levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in liver tissue of rats exposed to different concentrations of fluoride

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