崔丹丹 馬雯雯 文 露 宋坤琨 丁嘉慧 黃 聰 張明敏

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030

近年來，隨著生活壓力的增加，女性絕經(jīng)年齡提前，卵巢功能低下現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。卵巢儲備功能，又稱卵巢儲備（ovarian reserve），是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長、發(fā)育、并形成可受精的卵母細(xì)胞的能力，能反映女性的生育潛能和生殖內(nèi)分泌功能。若卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)目減少及卵子質(zhì)量下降則稱為卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR），常伴有經(jīng)量減少，月經(jīng)稀發(fā)甚至閉經(jīng)、不孕等，嚴(yán)重影響患者的身心健康，乃至家庭的穩(wěn)定，所以積極防治十分必要。DOR的發(fā)病率國內(nèi)尚未見報道，但有日益增多的趨勢。DOR進(jìn)一步可發(fā)展為卵巢早衰，而卵巢早衰病因不明［1－3］，治療頗為棘手，尚無有效治療措施，因此如何減緩卵巢功能衰退的速度以恢復(fù)卵巢功能，進(jìn)而提高生活質(zhì)量，是目前生殖內(nèi)分泌研究的一項重要課題。

傳統(tǒng)中醫(yī)典籍尚無DOR相對應(yīng)病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬“月經(jīng)后期或過少”、“閉經(jīng)”、“血枯”、“血隔”、“斷經(jīng)前后諸證”、“不孕”等范疇，目前尚缺乏系統(tǒng)、全面的理論闡述和證治方法。但從補腎調(diào)沖著手辨證論治，顯示了中醫(yī)藥療效的優(yōu)勢。本研究用C57BL／6J小鼠通過連續(xù)超促排卵及臭氧接觸建立生理性卵巢衰老模型，也即是DOR模型，探討歸腎丸對DOR小鼠的顆粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為臨床運用中藥治療卵巢功能衰退提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級5周齡C57BL／6J雌性小鼠，由武漢大學(xué)實驗動物中心提供。所有小鼠均飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心屏障系統(tǒng)。嚴(yán)格保證飼養(yǎng)環(huán)境為12h光照，12h暗室，溫度為18～22℃，相對濕度為70%～85%。雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食（標(biāo)準(zhǔn)飲食）。

1.2 主要試劑與儀器

歸腎丸為配方顆粒組方，顆粒制劑由三九醫(yī)藥制品有限公司提供，組方為：熟地濃縮顆粒6.0g（等于熟地20g），山茱萸濃縮顆粒1.7g（等于山茱萸10 g），山藥濃縮顆粒1.5g（等于山藥10g），菟絲子濃縮顆粒0.5g（等于菟絲子10g），枸杞濃縮顆粒4.0g（等于枸杞10g），杜仲濃縮顆粒0.5g（等于杜仲10 g），當(dāng)歸濃縮顆粒3.0g（等于當(dāng)歸10g），茯苓濃縮顆粒1.0g（等于茯苓10g）組成。人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）購自麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司，孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和前列腺素 F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）購自杭州動物藥品廠。蘇木精－伊紅試劑購自湖北百奧斯生物科技有限公司，F(xiàn)EI－Tecnai G212型透射電子顯微鏡購自荷蘭FEI電子光學(xué)有限公司。

1.3 模型建立及分組

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d左右，其后進(jìn)行陰道涂片，觀察動情周期，將連續(xù)2個動情周期正常的小鼠納入實驗，共16只小鼠隨機分為正常組、模型組、歸腎丸組和脫氫表雄酮（DHEA）組。參照 Miyamoto等［4］的方法，除正常組外的其他三組予以腹腔注射5IU PMSG，54h后給予5IU HCG腹腔注射，19h后再行25IU PGF2α腹腔注射。3次注射為1個周期，12h后開始下1個周期，共進(jìn)行10個周期。同時，實驗期間每天21∶00～次日9∶00將小鼠放入臭氧接觸箱中，保持臭氧接觸箱中臭氧濃度穩(wěn)定在2.8mg／m3。而正常組則接受生理鹽水腹腔注射，常規(guī)飼養(yǎng)。第10次連續(xù)超排HCG腹腔注射完成后次日上午，正常組及模型組給予生理鹽水0.3ml灌胃，歸腎丸組與DHEA組則給予相應(yīng)藥物灌胃，藥物劑量按照小鼠與人體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)計算后，每只小鼠每天灌胃0.3 ml。第21天灌胃結(jié)束后于動情后期頸椎脫臼處死，均從背腹側(cè)剖腹，迅速取出雙側(cè)卵巢，共得32個卵巢，其中16個卵巢放入2.5%戊二醛電鏡固定液，其余卵巢放入4%多聚甲醛固定。

1.4 蘇木精－伊紅染色觀察卵巢形態(tài)

卵巢固定包埋后，沿縱軸行連續(xù)切片，厚度為4μm，每2～3片貼于一張載玻片，采用蘇木精－伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)。

1.5 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察

卵巢組織塊用2.5%戊二醛與1%鋨酸雙固定，丙酮逐級脫水，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，于電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組卵巢蘇木精－伊紅染色

正常組小鼠卵巢內(nèi)可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡、初級卵泡位于淺層，數(shù)目較多，體積小，呈圓形或橢圓形；生長卵泡大小不一，成熟卵泡多位于淺表部，可見卵泡腔、卵細(xì)胞及卵丘結(jié)構(gòu)；顆粒細(xì)胞呈多層，形態(tài)完整，排列整齊，卵泡膜細(xì)胞呈梭形排列。模型組小鼠卵巢皮質(zhì)變薄，初級卵泡含量降低，多數(shù)卵泡呈囊性擴張，擴張的卵泡壁顆粒層細(xì)胞層次明顯減少，黃體計數(shù)較少；歸腎丸組與DHEA組中則可見卵巢皮質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞增生，同時可見皮質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多初級卵泡、生長卵泡及少量成熟卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)增加，黃體組織數(shù)量增多。見圖1。

2.2 卵巢透射電鏡結(jié)果

正常組的卵泡顆粒細(xì)胞，可見線粒體形態(tài)規(guī)則，管型明顯，數(shù)量豐富，且脂滴較多；模型組中線粒體腫脹明顯，還出現(xiàn)了空泡化改變，且較少看到脂滴，胞質(zhì)濃縮；歸腎丸組與DHEA組電鏡下均可見顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富，管型為管狀脊，胞質(zhì)內(nèi)含有大量脂滴。見圖2。

圖1 各組小鼠卵巢組織光鏡圖（蘇木精－伊紅染色，×400）

圖2 各組小鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)改變

3 討論

近年來，由于生活工作壓力的增加，環(huán)境的影響，以及不孕癥人口高齡化，卵巢儲備功能降低的患者逐漸增多，改善卵巢儲備功能降低患者的情況，提高妊娠率，是當(dāng)今生殖醫(yī)學(xué)和生殖健康研究的一個熱點和難點。卵巢功能低下是卵巢早衰的前奏，應(yīng)給予高度的重視和積極的治療。本實驗采用序貫連續(xù)超排卵10次以及臭氧吸入來造模，旨在觀察歸腎丸對卵巢功能衰退小鼠超微結(jié)構(gòu)的影響。

造模根據(jù)是基于自由基理論，由活性氧等引起的細(xì)胞內(nèi)氧化損傷是造成衰老的重要因素［5－6］，而連續(xù)超排卵能降低始基卵泡池的假說。新生兒的卵巢中約含有200萬個始基卵泡，而到絕經(jīng)時，卵巢中還剩下大約1 000個卵泡［7－8］。婦女在絕經(jīng)前，不間斷地卵泡發(fā)育（卵泡發(fā)育不同時期）展示了一種選擇性的生理性細(xì)胞死亡過程：大多數(shù)卵泡最終閉鎖消失，僅有不到1%的卵泡發(fā)育成熟、排卵。雖然卵泡閉鎖基本機制目前還不完全清楚，但越來越多的研究［9－10］表明，顆粒細(xì)胞凋亡觸發(fā)了卵泡閉鎖。本實驗研究結(jié)果顯示，正常組光鏡下可見到卵巢皮質(zhì)內(nèi)有較多的各級生長卵泡、成熟卵泡及黃體，而模型組生長卵泡較少，且電鏡觀察到其卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體較少，還出現(xiàn)了空泡化改變，且較少看到脂滴。而歸腎丸組與DHEA組，光鏡檢測結(jié)果顯示，均可見各級生長卵泡及成熟卵泡、黃體數(shù)目均較多。電鏡下可見其線粒體豐富，管型明顯，胞質(zhì)內(nèi)有大量脂滴。膽固醇是合成性激素的重要原料，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)含大量的膽固醇時則以脂滴形式存在［11］。有報道［12］稱，高電子密度脂滴在較年輕顆粒細(xì)胞中比較常見，但在年紀(jì)較大的顆粒細(xì)胞中基本不出現(xiàn)，這與本文的結(jié)果一致。因此推斷連續(xù)超排聯(lián)合臭氧吸入可能通過影響細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝，進(jìn)而導(dǎo)致甾體激素合成的下降，造成卵巢功能低下，而歸腎丸明顯能夠改善其卵巢超微結(jié)構(gòu)，是否能夠?qū)е络摅w激素合成的增加，尚需進(jìn)一步深入的研究。

近年來，DOR病例在臨床上比較常見，對其產(chǎn)生的病理機制仍不十分清楚，治療多以激素為主。許多研究［13－15］顯示，DHEA 可以改善卵巢儲備功能，提高妊娠率，降低流產(chǎn)率，也有報道［16］稱，DHEA能提高卵巢反應(yīng)不良患者的雄激素水平，有效改善其卵巢儲備功能和促排卵效果，進(jìn)而提高IVF－ET的妊娠率。故本實驗使用DHEA作為對照治療組。DOR在中醫(yī)學(xué)范疇屬于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)斷前后諸證、不孕等。由于腎在中醫(yī)理論中對于女性生殖生理非常重要，如《素問·上古天真論》云：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長；二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”。故認(rèn)為腎虛乃DOR的主要病理基礎(chǔ)。本實驗選用具有補腎作用的歸腎丸，研究其對DOR模型小鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)的影響，以期給臨床治療提供強有力的依據(jù)。

本實驗結(jié)果提示，歸腎丸能改善DOR模型小鼠顆粒細(xì)胞線粒體腫脹、空泡化以及脂滴的情況，而顆粒細(xì)胞線粒體的改變是否會導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的凋亡，脂滴的減少是否會導(dǎo)致甾體類激素的下降，尚需要進(jìn)一步的研究。

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