牛文民 劉智斌 楊曉航 王 淵

陜西中醫(yī)學(xué)院針灸系實驗研究中心，西安 712046

阿茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是嚴(yán)重危害老年人生命健康和生活質(zhì)量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。本研究團隊多年來從事嗅三針療法治療AD的臨床及實驗研究，證實該療法能夠有效干預(yù)AD病理過程［1－5］，本研究通過進一步觀察嗅三針療法對AD大鼠海馬組織中蛋白激酶A（PKA）活性的影響，深入探討嗅三針治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇成年SD雄性大鼠50只，體重（300±10）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器

Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（北京現(xiàn)代太極電子有限公司）；Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀（美國Bio－rad公司）。

1.3 大鼠模型制作

1.3.1 AD大鼠模型制作 將Aβ1～40肽段溶于滅菌蒸餾水中，濃度為5g／L，淀粉樣蛋白Aβ1～40試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，用前37℃孵育48 h，使其變?yōu)槟蹱顟B(tài)的Aβ。用10%水合氯醛（0.4 ml／100g體重）腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀。常規(guī)無菌操作，切開皮膚，參照包新民等［6］繪制《大鼠腦立體定向圖譜》，選擇左側(cè)海馬為注射靶區(qū)（前囟后3.5mm，中縫左側(cè)旁開2.0mm，硬腦膜下2.8mm）用牙科鉆在顱骨對應(yīng)位置開直徑為1mm的2個小孔，暴露硬腦膜，微量進樣器自腦表面垂直進針2.8mm，將 Aβ1～40肽段2 μ（10 μg），緩慢（0.5 μl／min）注入，留針5min以保證溶液充分?jǐn)U散，然后緩慢撤針（3min），縫合切口。手術(shù)部位施以適量青霉素抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)［7］。

1.3.2 AD嗅神經(jīng)切斷大鼠模型制作 參照羨慕等［8］報道的切斷嗅神經(jīng)方法，將AD造模后的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立體定位儀上。在大鼠顱頂正中切開皮膚，小范圍分離暴露前囟。在大鼠顱頂正中線位于前囟前面5mm兩側(cè)旁開2mm處，分別鉆2個直徑為1mm的小孔，深度至暴露嗅球，但不損傷嗅球；使用顯微解剖鑷提起嗅球前端的硬腦膜，銳性切斷嗅神經(jīng)，盡量避免傷及嗅球，同時明膠海綿壓迫止血，傷口處點青、鏈霉素，縫合傷口。對照組僅于顱頂鉆孔后即縫合皮膚，不傷及嗅球及嗅神經(jīng)。

1.4 動物分組及處理

將大鼠隨機分為正常對照組、AD模型組、AD＋嗅神經(jīng)切斷模型組、嗅三針組和嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組，每組10只。嗅三針組和嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組均進行嗅三針治療，正常對照組、AD模型組和AD嗅神經(jīng)切斷模型組，每日1次，采取與以上兩組相同的捉拿固定，但不施加任何干預(yù)措施。

嗅三針穴位定位：依據(jù)李忠仁教授［9］主編的《實驗針灸學(xué)》動物選穴標(biāo)準(zhǔn)，選取兩側(cè)迎香及印堂穴。迎香穴位于大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處；印堂穴位于大鼠兩眼眶上緣中點連線與正中線交點。操作：選用“華佗牌”不銹鋼針，30號0.5寸毫針。于迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.3cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3cm；電針儀：G6805電針儀（上海醫(yī)療儀器廠）；刺激參數(shù)：疏密波，頻率80～100Hz；刺激強度：以保持針刺局部輕微抖動為度（電流強度：1～3mA，電壓：1～3V）；時間：留針10min，持續(xù)電刺激，每日1次。5 d為1個療程，休息2d，共進行6個療程。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮定位航行實驗 治療結(jié)束后，開始水迷宮測試［10］。水迷宮內(nèi)水深41cm，水溫22～26℃。在水池壁標(biāo)明4個入水點，由此將水池等分為4個象限，任選一象限正中放置平臺，沒于水下1cm，水面覆蓋塑料泡沫。將受試大鼠按順時針方向依次由E、S、W、N 4個入水點順序面向池壁放入水中，記錄2min內(nèi)尋找平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2min內(nèi)找到平臺，記錄其實際逃避潛伏期及游泳路程；如果大鼠在2min內(nèi)未找到平臺，由測試者將其引上平臺并停留10s，逃避潛伏期記錄為2min。歷時6d，每日1次。以6d找到平臺的平均逃避潛伏期和平均游泳路程評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.5.2 海馬組織的PKA活性測定 實驗結(jié)束后快速將大鼠斷頭取腦，分離海馬，取適量海馬組織樣品，迅速標(biāo)號放入EP管投入液氮中，隨后置于－70℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２捎蒙锼仉p抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定海馬中的PKA活性。具體操作過程嚴(yán)格按照PKA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用說明書進行（試劑盒購自南京建成生物工程研究院）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析、組間均值進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗情況

大鼠6d平均逃避潛伏期和平均游泳路程比較，AD模型組及AD＋嗅神經(jīng)切斷組均顯著長于正常組（P＜0.01）；嗅三針組與嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組均顯著短于 AD模型組（P＜0.01，P＜0.05）；嗅三針組短于嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組（P＜0.05）；AD模型組與AD＋嗅神經(jīng)切斷組相比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果比較（n＝10，±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果比較（n＝10，±s）

與模型組比較＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01；與嗅三針組比較△ P＜0.05

組別 平均逃避潛伏期（s）平均游泳路程（cm）正常對照組 18.25±9.25＊＊ 115.56±18.15＊＊ AD模型組 116.61±24.33 189.65±25.33 AD＋嗅神經(jīng)切斷組 123.95±25.36 185.58±25.21嗅三針組 76.16±10.12＊＊ 128.12±14.25＊＊ 嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組 95.12±15.12＊△ 152.18±15.12＊△

2.2 各組大鼠海馬組織PKA活性

各組大鼠海馬組織PKA活性比較，正常對照組、嗅三針組和嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組均明顯高于AD模型組（P＜0.01）；嗅三針組高于嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組（P＜0.05）；AD模型組與AD＋嗅神經(jīng)切斷組相比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織PKA活性的比較（n＝10，ng／L，±s）

表2 各組大鼠海馬組織PKA活性的比較（n＝10，ng／L，±s）

與模型組比較＊＊ P＜0.01；與嗅三針組比較△ P＜0.05

PKA正常對照組 456.65±73.15組別＊＊AD模型組 281.68±32.28 AD＋嗅神經(jīng)切斷組 270.86±32.34嗅三針組 369.88±65.31＊＊ 嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組 311.52±53.22＊＊△

3 討論

蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）是第二信使cAMP依賴的蛋白激酶，是細胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要激酶。細胞外刺激信號經(jīng)細胞膜受體使腺苷酸環(huán)化酶活化，從而催化ATP生成cAMP，由此激活PKA，促進PKA進入細胞核發(fā)生磷酸化，最終激活cAMP反應(yīng)成分結(jié)合原件（cAMP－response element binding protein，CREB），啟動基因的轉(zhuǎn)錄，然后產(chǎn)生一系列功能調(diào)節(jié)活動?，F(xiàn)已確認(rèn)，cAMP／PKA－CREB信號通路在學(xué)習(xí)與記憶形成機制中發(fā)揮著重要作用［11］。

有研究［12］證實，AD 的腦組織中cAMP／PKA／CREB信號通路明顯受損，尤其是海馬CA1區(qū)的PKA活性顯著降低，影響了突觸可塑性，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶特別是長時程記憶形成障礙。有研究［13］表明，針刺治療能明顯提高AD大鼠海馬內(nèi)PKA的活性，從而恢復(fù)學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究結(jié)果顯示，嗅三針能夠明顯增強AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且能提高AD模型大鼠海馬組織中PKA的活性。然而，嗅三針＋嗅神經(jīng)切斷組雖然其學(xué)習(xí)記憶能力也有所增強，且海馬組織PKA的活性升高，但其水平不及嗅三針組，兩組結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明嗅三針對于AD大鼠的療效主要是通過嗅覺傳導(dǎo)通路對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響的，這與本團隊先前的研究［1－5］結(jié)果相一致。

本研究證實了嗅三針療法對AD具有確切的治療作用，其作用機制與調(diào)節(jié)海馬組織PKA的活性密切相關(guān)，其療效的發(fā)揮有賴于嗅覺傳導(dǎo)通路的完整性。

［1］牛文民，劉智斌，楊曉航，等.嗅三針對癡呆大鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能影響［J］.針灸臨床雜志，2008，24（10）：38－39.

［2］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對老年癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬膽堿乙?；?、乙酰膽堿酯酶活性的影響［J］.針刺研究，2009，34（1）：48－51.

［3］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對癡呆大鼠大腦邊緣葉膽堿能系統(tǒng)功能的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15（3）：206－207.

［4］劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針對阿爾茨海默病大鼠海馬Bcl－2和Bax表達的干預(yù)效應(yīng)［J］.針刺研究，2011，36（1）：7－11.

［5］楊曉航，劉智斌，牛文民，等.嗅三針對阿爾茨海默病大鼠海馬毒覃堿型受體的影響［J］.針刺研究，2011，36（2）：90－94.

［6］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.

［7］庫寶善.神經(jīng)精神藥理學(xué)［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006：479－480.

［8］羨慕，魏永祥，韓德民，等.嗅神經(jīng)切斷術(shù)后白血病抑制因子在嗅上皮中的表達［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2005，12（6）：377－380.

［9］李忠仁.實驗針灸學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2004：327－329.

［10］MORRIS RG，GARRUD P，RAWLINS IN，et al.Place navigation impared in rats with hippocampal lessens［J］.Nature，1982，297（5868）：681－683.

［11］MUNNO DW，PRINCE DJ，SYED NI.Synapse number and synaptic efficacy are reguLated by presynaptic c－AMP and PKA［J］.J Neurosci，2003，23（10）：4146－4155.

［12］MATSUSHITA M，TOMIZAWA K，MORIWAKI A，et al.A high efficiency protein transduction system demonstrating the role of PKA in long lasting LTP.［J］.J Neuro Sci，2001，（21）：6000－6007.

［13］沈峰，孫國杰.電針對AD大鼠海馬PKA影響的實驗研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（4）：731－732.