趙云飛

摘 要：半胱氨酸蛋白酶是人體自身產(chǎn)生的重要酶類物質，它廣泛的參與人體新陳代謝和蛋白的水解。但過量產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶會導致骨質疏松和乳腺癌。腈基類化合物分子是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抑制半胱氨酸蛋白酶作用的靶向藥物分子，高效且低副作用。但是它的抑制機理一直沒有得到解決。本文介紹借助量子力學/分子力學（QM/MM）的計算研究，解得了此類化合物對于半胱氨酸蛋白酶的抑制機理，并借助分子學軟件設計了一種新型藥物分子，有助進一步藥物研究。

關鍵詞：半胱氨酸蛋白酶 組織蛋白酶K 量子力學/分子力學（QM/MM）

中圖分類號：R969.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2014）04（b）-0097-04

The Mechanism of Inhibition of Cysteine Protease

ZHAO Yunfei

（School of Life Science， Tsinghua University， Beijing）

Abstract： Cysteine protease is a vital enzyme for human metabolism and involved in a proteolysis reaction in human body. However， over-expressed cysteine proteases can cause serious diseases such as osteoporosis and breast cancer. Nitrile-based inhibitors are newly-discovered substrates as well as drugs which can inhibit cysteine proteases with high efficiency and low side-effects. However， the mechanism of inhibition remains unknown. This paper illustrates a novel computational calculation performed by quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM） to resolve this mechanism. We find a stepwise mechanism whereby the deprotonated anionic sulfur atom from cysteine of the active site of Cathepsin K attacks a nitrile containing substrate to form an intermediate structure， followed by a deprotonation reaction to form a lower energy product state structure， and therefore， this mechanism of inhibition of cysteine protease has been resolved.

Keywords： Cysteine protease Cathepsin K quantum mechanics/molecular mechanics （QM/MM）

1 概況

半胱氨酸酶作為六大酶類之一，廣泛存在于各種生物有機體內，如病毒、細菌、原生動物、植物和哺乳動物[1]，主要參與人體新陳代謝和蛋白質的水解。近年來，人類成功的從植物中提取出半胱氨酸酶作為藥物治療腸內蠕蟲的感染[2]。它對結籽期內植物的生長和人類骨骼的發(fā)育起著至關重要的作用。

半胱氨酸酶的蛋白質水解途徑如圖1所示。它的催化位點由一個帶硫基的半胱氨酸基團和一個組氨酸基團組成[3]。盡管蛋白質的水解過程是不可逆的，但在一些特定的條件下，蛋白質會通過一系列轉錄后的修飾，使得原先的不可逆變成可逆。

組織蛋白酶是半胱氨酸酶家族中的一類，可細分成組織蛋白酶B、C、F、H、K、L1、O、S、W和Z。組織蛋白酶K將作為半胱氨酸酸酶的代表被本文所研究，因為其主要參與了人體的骨吸收作用[4]并首次發(fā)現(xiàn)于兔子的破骨細胞中，且同樣大量產(chǎn)生于人體的破骨細胞。過程如圖2所示。

組織蛋白酶K的功能在于通過水解人體膠原蛋白和彈性蛋白達到骨質破壞的作用，此功能在人體骨骼生長時起著至關重要的作用。組織蛋白酶K的缺失會導致骨質的脆性增大，病人容易患致密性成骨不全癥[5]。相反，過量的產(chǎn)生組織蛋白酶K會侵蝕骨基質蛋白，如骨橋蛋白、骨粘連蛋白、膠原蛋白I和II，導致骨關節(jié)炎和骨質疏松[6]。同時，過量的組織蛋白酶K會大大增加得乳腺癌的風險，并因此血液中組織蛋白酶K濃度的檢測已作為診斷乳腺癌的重要指標之一，因為破骨細胞對膠原蛋白的破壞有助于癌細胞的增長和擴散[7]且乳腺癌細胞也能夠大量產(chǎn)生過量的組織蛋白酶K。

2 理論與模型

以前的化學家利用塑料制的棍子來為自己搭建化學分子式的3D模型。如今我們利用基于經(jīng)典物理學和量子力學原理的軟件來設計最優(yōu)化的分子結構模型，例如一個化學分子中鍵與鍵之間的夾角，以及原子與原子之間的距離，都可以通過計算使得分子的空間結構最優(yōu)化（分子結構式能量最低）。計算機模型的介入對于我們研究反應速度極快的酶反應過程中的不穩(wěn)定中間體和過度狀態(tài)帶來巨大的幫助，因為到目前為止，對于酶反應過程中的中間體的分子3D結構，在實驗室條件下還無法觀測。

分子力學（MM）是基于經(jīng)典物理學的理論，用于闡述分子結構式的空間結構和分子勢能的計算。在MM的計算原理中，因為它忽略了分子系統(tǒng)中電子和原子核之間的相互作用，所以它不能夠用于計算化學反應中有鍵與鍵的斷裂或形成的分子勢能。但是它仍然可以精確的計算出大分子量（由上千原子組成）的分子結構式。endprint

量子力學（QM）相對于分子力學而言，它更側重于計算出電子和原子核之間的相互作用力。量子力學/分子力學（QM/MM）的計算方法則可以精確的計算出酶分子在反應過程中任意階段的分子勢能的變化。因為它將酶分子的勢能分開單獨計算，活性催化位點（反應過程中包含大量分子鍵的斷裂和形成，原子數(shù)量一般在60個左右）利用QM來計算，而其余惰性分子區(qū)域（包括包裹在酶分子周圍的水分子）則采用MM計算方法。

目前，半胱氨酸抑制劑主要可分為羰基類化合物、腈基類化合物和其它與半胱氨酸酶非共價結合類抑制物。半胱氨酸酶抑制劑的發(fā)展史可以被認為是與半胱氨酸酶的不可逆結合到可逆結合。盡管非共價結合抑制物已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)都屬于多肽大分子化合物，由于它們的大分子量和大體積以至于它們的抑制效果非常不好。不可逆結合類抑制物曾在過去一段時間內非常流行，因為此類化合物具有極強的靶向型并被多篇研究報道以及市場化。然而近期我們發(fā)現(xiàn)此類藥物在長期服用的情況下會導致免疫性和抗原性的并發(fā)癥。所以，研究人員越來越傾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。

腈基類化合物作為小分子、共價結合類抑制劑具有極為優(yōu)越的高效、低毒效果受到人們青睞，但其抑制機理從未被揭示。本研究將利用計算機模型計算的方法，證實我們假設的腈基類化合物的抑制機理的可行性（圖3所示）。

3 結論

我們通過對腈基類化合物與組織蛋白酶K的結合物系統(tǒng)進行結構優(yōu)化后，得到的產(chǎn)物結構（QM部分）如圖4所示；能量掃描結構圖像如圖5所示。

通過對圖5所得到的結構能量掃描圖的分析，其符合生化反應的能量變化規(guī)律。且我們通過QM/MM計算方式，系統(tǒng)成功的得到我們想要的最優(yōu)化的系統(tǒng)反應中間態(tài)。充分證明了我們設想的腈基類化合物的抑制機理的可行性（圖3）。其中我們設計的新型腈基類抑制底物具有臨床研究價值。

4 實驗部分

首先，我們使用Gaussian View軟件去設計最初的一種腈基類抑制化合物，再通過UB3LYP（6-31G）計算程序對化合物分子結構進行優(yōu)化，優(yōu)化前后的分子空間結構如圖6所示。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的分子能量（kcal mol-1）比優(yōu)化前低（ΔE= -1838.6），說明優(yōu)化后的結構比優(yōu)化前穩(wěn)定的多。

其次，我們從PDB文件（1U9V）中刪除原先的抑制分子IHE，利用Chimera軟件將新設計的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住組織蛋白酶K的催化位點（由CYS 25和HIS 162組成）（圖7）?；赒M/MM的理論，利用Multilayer Onion Model計算方法我們將CYS 25中的硫原子設為中心點，與之長度為8 Angstroms的空間內包含的所有原子設定為QM區(qū)域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM區(qū)域內。其余都設定為MM區(qū)域（包含3160個原子）。用程序UB3LYP（6-31G）優(yōu)化QM區(qū)域。用程序UFF優(yōu)化MM區(qū)域。再利用CHARMM軟件向最新優(yōu)化后的PDB文件中加入水分子，將整個體系包含在直徑為60 Angstroms的水球內，如圖8所示。

最后，我們將加入水分子后的大系統(tǒng)通過之前同樣的Multilayer Onion Model計算方法將系統(tǒng)結構優(yōu)化，得到最終的能量最低的產(chǎn)物狀態(tài)（C），隨后我們依照圖3的反應式往回通過掃描式計算的方法得到中間態(tài)的產(chǎn)物結構。首先，我們切斷帶有腈基集團底物上的N-H鍵，并同時縮小H 3248和與之相鄰的組氨酸集團（HIS 162）的N 2361之間的距離，通過輸入指令：

3248 2361 S 10 -0.05

表明我們人為通過10個反應步驟（步步使用Multilayer Onion Model計算方法進行系統(tǒng)優(yōu)化）縮小H 3248和N 2361的距離，每一步的縮小距離是0.05 angstroms。我們得到掃描式計算中能量最高點的系統(tǒng)結構（TSB）和能量最低點的系統(tǒng)結構（B）。所有原子的數(shù)值標記都根據(jù)原始GJF文件。

我們隨之將系統(tǒng)結構B依照圖三的反應式繼續(xù)往回通過同樣的掃描計算式方法，首先切斷中間底物（腈基化合物）的C-S鍵，并同時增大S 367與之相鄰的半胱氨酸基團（CYS 25）的C 3249之間的距離，通過輸入指令：

3249 367 S 10 0.1

表明我們人為通過10個反應步驟（步步使用Multilayer Onion Model計算方法進行系統(tǒng)優(yōu)化）增加S 367和C 3249的距離，每一步的增加距離是0.1 angstroms。

最終，我們從結合物C逆計算得到產(chǎn)物A、TSA、B、TSB的結構如圖9所示。

參考文獻

[1] Barrett， A. In Proteinase Inhibitors； Barrett， A.， Salvesen， G.， Eds.； Elsevier： Amsterdam， 1986-3-22.

[2] Sharma， A.； Padwal-Desai， S.； Ninjoor， V. Biochem. Biophys.， Res. Commun. 1989， 159， 464-471.Scottk. Thompson， Stacie M. Halbert， Mary J. Bossard[J].Proc， Natl. Acad， Sci， USA， 1997，94：14249-14254.

[3]Garnero P， Sornary-Rendu E， Chapuy MC， Delmas PD. J. Bone Miner Res. 1996； 11： 337-49.Andrew D. Morley， Peter W. Kenny[J].Bioorg. Med. Chem. Lett.，2009，19：1658-1661.

[4] Le Gall C， Bellahcene A， Bonnelve E， Cancer Res[J].2007，67（20）： 9894-902.

[5] Jiaqiang Cai，Craig Jamieson， Jennifer Moir，et al.Cathepsin K inhibitors，2000-2004，Expert. Opin.Ther[J].2005，15（1）：33-48.

[6] Eva Altmann.2-Cyano-pyrimidines：A New Chemotype for Inhibitors of the Cysteine Protease Cathepsin K[J].Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（4）：591-594.

[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.endprint

量子力學（QM）相對于分子力學而言，它更側重于計算出電子和原子核之間的相互作用力。量子力學/分子力學（QM/MM）的計算方法則可以精確的計算出酶分子在反應過程中任意階段的分子勢能的變化。因為它將酶分子的勢能分開單獨計算，活性催化位點（反應過程中包含大量分子鍵的斷裂和形成，原子數(shù)量一般在60個左右）利用QM來計算，而其余惰性分子區(qū)域（包括包裹在酶分子周圍的水分子）則采用MM計算方法。

目前，半胱氨酸抑制劑主要可分為羰基類化合物、腈基類化合物和其它與半胱氨酸酶非共價結合類抑制物。半胱氨酸酶抑制劑的發(fā)展史可以被認為是與半胱氨酸酶的不可逆結合到可逆結合。盡管非共價結合抑制物已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)都屬于多肽大分子化合物，由于它們的大分子量和大體積以至于它們的抑制效果非常不好。不可逆結合類抑制物曾在過去一段時間內非常流行，因為此類化合物具有極強的靶向型并被多篇研究報道以及市場化。然而近期我們發(fā)現(xiàn)此類藥物在長期服用的情況下會導致免疫性和抗原性的并發(fā)癥。所以，研究人員越來越傾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。

腈基類化合物作為小分子、共價結合類抑制劑具有極為優(yōu)越的高效、低毒效果受到人們青睞，但其抑制機理從未被揭示。本研究將利用計算機模型計算的方法，證實我們假設的腈基類化合物的抑制機理的可行性（圖3所示）。

3 結論

我們通過對腈基類化合物與組織蛋白酶K的結合物系統(tǒng)進行結構優(yōu)化后，得到的產(chǎn)物結構（QM部分）如圖4所示；能量掃描結構圖像如圖5所示。

通過對圖5所得到的結構能量掃描圖的分析，其符合生化反應的能量變化規(guī)律。且我們通過QM/MM計算方式，系統(tǒng)成功的得到我們想要的最優(yōu)化的系統(tǒng)反應中間態(tài)。充分證明了我們設想的腈基類化合物的抑制機理的可行性（圖3）。其中我們設計的新型腈基類抑制底物具有臨床研究價值。

4 實驗部分

首先，我們使用Gaussian View軟件去設計最初的一種腈基類抑制化合物，再通過UB3LYP（6-31G）計算程序對化合物分子結構進行優(yōu)化，優(yōu)化前后的分子空間結構如圖6所示。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的分子能量（kcal mol-1）比優(yōu)化前低（ΔE= -1838.6），說明優(yōu)化后的結構比優(yōu)化前穩(wěn)定的多。

其次，我們從PDB文件（1U9V）中刪除原先的抑制分子IHE，利用Chimera軟件將新設計的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住組織蛋白酶K的催化位點（由CYS 25和HIS 162組成）（圖7）?；赒M/MM的理論，利用Multilayer Onion Model計算方法我們將CYS 25中的硫原子設為中心點，與之長度為8 Angstroms的空間內包含的所有原子設定為QM區(qū)域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM區(qū)域內。其余都設定為MM區(qū)域（包含3160個原子）。用程序UB3LYP（6-31G）優(yōu)化QM區(qū)域。用程序UFF優(yōu)化MM區(qū)域。再利用CHARMM軟件向最新優(yōu)化后的PDB文件中加入水分子，將整個體系包含在直徑為60 Angstroms的水球內，如圖8所示。

最后，我們將加入水分子后的大系統(tǒng)通過之前同樣的Multilayer Onion Model計算方法將系統(tǒng)結構優(yōu)化，得到最終的能量最低的產(chǎn)物狀態(tài)（C），隨后我們依照圖3的反應式往回通過掃描式計算的方法得到中間態(tài)的產(chǎn)物結構。首先，我們切斷帶有腈基集團底物上的N-H鍵，并同時縮小H 3248和與之相鄰的組氨酸集團（HIS 162）的N 2361之間的距離，通過輸入指令：

3248 2361 S 10 -0.05

表明我們人為通過10個反應步驟（步步使用Multilayer Onion Model計算方法進行系統(tǒng)優(yōu)化）縮小H 3248和N 2361的距離，每一步的縮小距離是0.05 angstroms。我們得到掃描式計算中能量最高點的系統(tǒng)結構（TSB）和能量最低點的系統(tǒng)結構（B）。所有原子的數(shù)值標記都根據(jù)原始GJF文件。

我們隨之將系統(tǒng)結構B依照圖三的反應式繼續(xù)往回通過同樣的掃描計算式方法，首先切斷中間底物（腈基化合物）的C-S鍵，并同時增大S 367與之相鄰的半胱氨酸基團（CYS 25）的C 3249之間的距離，通過輸入指令：

3249 367 S 10 0.1

表明我們人為通過10個反應步驟（步步使用Multilayer Onion Model計算方法進行系統(tǒng)優(yōu)化）增加S 367和C 3249的距離，每一步的增加距離是0.1 angstroms。

最終，我們從結合物C逆計算得到產(chǎn)物A、TSA、B、TSB的結構如圖9所示。

參考文獻

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[4] Le Gall C， Bellahcene A， Bonnelve E， Cancer Res[J].2007，67（20）： 9894-902.

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[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.endprint

量子力學（QM）相對于分子力學而言，它更側重于計算出電子和原子核之間的相互作用力。量子力學/分子力學（QM/MM）的計算方法則可以精確的計算出酶分子在反應過程中任意階段的分子勢能的變化。因為它將酶分子的勢能分開單獨計算，活性催化位點（反應過程中包含大量分子鍵的斷裂和形成，原子數(shù)量一般在60個左右）利用QM來計算，而其余惰性分子區(qū)域（包括包裹在酶分子周圍的水分子）則采用MM計算方法。

目前，半胱氨酸抑制劑主要可分為羰基類化合物、腈基類化合物和其它與半胱氨酸酶非共價結合類抑制物。半胱氨酸酶抑制劑的發(fā)展史可以被認為是與半胱氨酸酶的不可逆結合到可逆結合。盡管非共價結合抑制物已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)都屬于多肽大分子化合物，由于它們的大分子量和大體積以至于它們的抑制效果非常不好。不可逆結合類抑制物曾在過去一段時間內非常流行，因為此類化合物具有極強的靶向型并被多篇研究報道以及市場化。然而近期我們發(fā)現(xiàn)此類藥物在長期服用的情況下會導致免疫性和抗原性的并發(fā)癥。所以，研究人員越來越傾向于研究新型的小分子可逆抑制型化合物。

腈基類化合物作為小分子、共價結合類抑制劑具有極為優(yōu)越的高效、低毒效果受到人們青睞，但其抑制機理從未被揭示。本研究將利用計算機模型計算的方法，證實我們假設的腈基類化合物的抑制機理的可行性（圖3所示）。

3 結論

我們通過對腈基類化合物與組織蛋白酶K的結合物系統(tǒng)進行結構優(yōu)化后，得到的產(chǎn)物結構（QM部分）如圖4所示；能量掃描結構圖像如圖5所示。

通過對圖5所得到的結構能量掃描圖的分析，其符合生化反應的能量變化規(guī)律。且我們通過QM/MM計算方式，系統(tǒng)成功的得到我們想要的最優(yōu)化的系統(tǒng)反應中間態(tài)。充分證明了我們設想的腈基類化合物的抑制機理的可行性（圖3）。其中我們設計的新型腈基類抑制底物具有臨床研究價值。

4 實驗部分

首先，我們使用Gaussian View軟件去設計最初的一種腈基類抑制化合物，再通過UB3LYP（6-31G）計算程序對化合物分子結構進行優(yōu)化，優(yōu)化前后的分子空間結構如圖6所示。我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的分子能量（kcal mol-1）比優(yōu)化前低（ΔE= -1838.6），說明優(yōu)化后的結構比優(yōu)化前穩(wěn)定的多。

其次，我們從PDB文件（1U9V）中刪除原先的抑制分子IHE，利用Chimera軟件將新設計的化合物底物插入到原先IHE分子的位置，堵住組織蛋白酶K的催化位點（由CYS 25和HIS 162組成）（圖7）?；赒M/MM的理論，利用Multilayer Onion Model計算方法我們將CYS 25中的硫原子設為中心點，與之長度為8 Angstroms的空間內包含的所有原子設定為QM區(qū)域，共有底物、HIS 162、CYS 25、ALA 163、GLY 64和GLY 65包含在QM區(qū)域內。其余都設定為MM區(qū)域（包含3160個原子）。用程序UB3LYP（6-31G）優(yōu)化QM區(qū)域。用程序UFF優(yōu)化MM區(qū)域。再利用CHARMM軟件向最新優(yōu)化后的PDB文件中加入水分子，將整個體系包含在直徑為60 Angstroms的水球內，如圖8所示。

最后，我們將加入水分子后的大系統(tǒng)通過之前同樣的Multilayer Onion Model計算方法將系統(tǒng)結構優(yōu)化，得到最終的能量最低的產(chǎn)物狀態(tài)（C），隨后我們依照圖3的反應式往回通過掃描式計算的方法得到中間態(tài)的產(chǎn)物結構。首先，我們切斷帶有腈基集團底物上的N-H鍵，并同時縮小H 3248和與之相鄰的組氨酸集團（HIS 162）的N 2361之間的距離，通過輸入指令：

3248 2361 S 10 -0.05

表明我們人為通過10個反應步驟（步步使用Multilayer Onion Model計算方法進行系統(tǒng)優(yōu)化）縮小H 3248和N 2361的距離，每一步的縮小距離是0.05 angstroms。我們得到掃描式計算中能量最高點的系統(tǒng)結構（TSB）和能量最低點的系統(tǒng)結構（B）。所有原子的數(shù)值標記都根據(jù)原始GJF文件。

我們隨之將系統(tǒng)結構B依照圖三的反應式繼續(xù)往回通過同樣的掃描計算式方法，首先切斷中間底物（腈基化合物）的C-S鍵，并同時增大S 367與之相鄰的半胱氨酸基團（CYS 25）的C 3249之間的距離，通過輸入指令：

3249 367 S 10 0.1

表明我們人為通過10個反應步驟（步步使用Multilayer Onion Model計算方法進行系統(tǒng)優(yōu)化）增加S 367和C 3249的距離，每一步的增加距離是0.1 angstroms。

最終，我們從結合物C逆計算得到產(chǎn)物A、TSA、B、TSB的結構如圖9所示。

參考文獻

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[7] Philip A.MacFaul，Andrew D.Morley，James J.Crawford.A simple in vitro assay for assessing the reactivity of nitrile containing compounds[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2009，19：1136-1138.endprint