張?zhí)戽? 郭 澍, 于艷秋, 王晨超, 孫 強

實驗研究

體外擴增培養(yǎng)對兔脂肪來源干細胞的衰老及成骨分化能力的影響

張?zhí)戽? 郭 澍, 于艷秋, 王晨超, 孫 強

目的探討體外擴增培養(yǎng)對兔脂肪來源干細胞的衰老及成骨分化能力的影響。方法分離提取兔脂肪來源干細胞，取第5、10、15代細胞進行成骨誘導，并采用茜素紅染色法比較不同代數(shù)細胞的成骨能力，β-半乳糖苷酶染色法比較不同代數(shù)細胞的衰老程度。結(jié)果早期代數(shù)的細胞經(jīng)成骨誘導后，出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)的時間較早，且在同一誘導時間下，與晚期代數(shù)的細胞相比，形成的結(jié)節(jié)數(shù)量最多、體積最大。隨傳代次數(shù)的增加，細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積量呈下降趨勢，衰老細胞所占的比例呈上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論隨體外擴增培養(yǎng)，兔脂肪來源干細胞成骨分化能力減弱，細胞發(fā)生衰老程度增強。

脂肪來源干細胞； 擴增； 衰老； 成骨

臨床上因先天畸形、創(chuàng)傷及腫瘤等原因造成的顱頜面部骨性缺損，大大降低了患者的生活質(zhì)量，骨缺損的重建是亟待解決的問題。骨組織工程的出現(xiàn)為骨缺損的修復(fù)開辟了一條新道路，其中脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)作為新生的種子細胞，在組織工程的研究中得到了廣泛的關(guān)注[1-4]。但是，有限的細胞數(shù)量需要體外擴增來培養(yǎng)一定量的細胞，供實驗研究[5-6]。本實驗于2013年9月，從兔的脂肪組織中提取出ADSCs，通過對其進行擴增培養(yǎng)，即長期傳代，探討體外擴增培養(yǎng)對兔ADSCs的衰老及成骨分化能力的影響，以期為基礎(chǔ)研究提供理論支持，為臨床應(yīng)用提供優(yōu)質(zhì)的種子細胞。

1 材料與方法

1.1 標本來源

普通級健康4個月齡雌性新西蘭大耳白兔6只，平均體質(zhì)量4 kg，由中國醫(yī)科大學動物部提供。

1.2 主要試劑和儀器

油紅O染液、茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶(美國SIGMA公司)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒(武漢碧云天生物技術(shù)研究所)；酶標儀(美國THEROMO公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 兔ADSCs的分離提取、培養(yǎng)及實驗分組 于兔臀部肌肉注射麻醉藥后，在其頸背部行縱行切口，顯露皮下脂肪，剪碎脂肪組織至糜狀。將分離提取的ADSCs，接種于培養(yǎng)皿中，以1∶3傳代，每2 d換液并觀察細胞生長狀態(tài)。實驗分組: 將體外培養(yǎng)的ADSCs分成3組。A組：第5代ADSCs；B組：第10代ADSCs；C組：第15代ADSCs。每組實驗重復(fù)6次。

1.3.2 ADSCs的多向誘導分化 成脂和成骨誘導組：當?shù)?代的細胞達到80%～90%匯合后，分別更換成脂誘導液和成骨誘導液。成脂誘導3周，油紅O染色鑒定其成脂分化能力[7]。成骨誘導4周，茜素紅染色鑒定其成骨分化能力。成脂和成骨對照組：均常規(guī)培養(yǎng)[7]。

1.3.3 不同代數(shù)組ADSCs的成骨誘導分化 取第5、10、15代細胞，分別以相同密度接種于6孔板中，當細胞達到80%～90%匯合后，更換成骨誘導液。分別于成骨誘導的第1、2、3、4周，行茜素紅染色及茜素紅半定量分析[8]。

1.3.4 不同代數(shù)組ADSCs的衰老檢測 取第5、10、15代的細胞，按照β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒使用說明進行操作，分別檢測不同代數(shù)組細胞的衰老程度，并隨機選出500個細胞，倒置顯微鏡下觀察并計算被染色的陽性細胞數(shù)，即為衰老細胞所占的百分數(shù)[9]。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察兔ADSCs的形態(tài)特征

ADSCs培養(yǎng)24 h后，鏡下可見大部分細胞已貼壁生長且呈寬大成纖維樣，原代細胞培養(yǎng)至7 d左右，細胞達80%～90%匯合，此時進行傳代培養(yǎng)。細胞傳至第3代時，形態(tài)呈均一的長梭形，漩渦狀生長(圖1)。

2.2 ADSCs的多向誘導分化

成脂誘導組：細胞在成脂誘導液的作用下形成脂肪空泡，空泡被油紅O染成紅色(圖2)。成骨誘導組：細胞在成骨誘導液的作用下形成礦化結(jié)節(jié)，礦化結(jié)節(jié)被茜素紅染成橘紅色。成脂和成骨對照組：無脂肪空泡及礦化結(jié)節(jié)形成。

2.3 不同代數(shù)組ADSCs的成骨誘導分化

茜素紅染色：第5代的ADSCs經(jīng)成骨誘導2周，便可出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，當成骨誘導至第4周時，隨傳代次數(shù)的增加，形成的礦化結(jié)節(jié)不僅數(shù)量逐漸減少，且體積相應(yīng)變小，其中第5代細胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量最多，體積最大(圖3)。

茜素紅半定量分析：成骨誘導第1周時，第5、10、15代細胞的細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積量無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；誘導至第2周，第5代成骨誘導組的鈣鹽沉積量大于第10、15代誘導組，而第10代和第15代之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；誘導至第3、4周，兩兩組間比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

2.4 不同代數(shù)組ADSCs的衰老檢測

隨體外連續(xù)傳代，細胞由典型的長梭形發(fā)展成不規(guī)則形態(tài)，體積變大、變扁，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒，細胞碎片增多，經(jīng)β-半乳糖苷酶染色，衰老的細胞被染成藍色。隨傳代次數(shù)的增加，被染色的衰老細胞增多(圖5)，鏡下計數(shù)細胞衰老率升高(圖6)。

3 討論

ADSCs在組織工程的研究中越來越受到重視，若想成為理想的種子細胞，需要在保持其多向分化能力的情況下，經(jīng)過體外的擴增培養(yǎng)，以供實驗及臨床需要[5-6]。Zuk等[10]認為，第15代之前的ADSCs，仍能保持其多向分化能力。Kang等[11]則持不同觀點，認為12代之后的ADSCs其多向分化能力是逐漸下降的。而Wall等[12]卻通過實驗證實，10代之內(nèi)的ADSCs在傳代的后期其成骨分化能力開始逐漸增強 。目前，關(guān)于體外擴增培養(yǎng)是否會對干細胞的成骨分化能力產(chǎn)生影響，并未達成共識[10-15]。本實驗從分子水平上研究體外擴增培養(yǎng)即長期傳代對ADSCs成骨分化能力的影響，并且進一步探究細胞衰老與成骨分化能力之間可能存在的關(guān)系。

在成骨誘導實驗中我們發(fā)現(xiàn)，不同代數(shù)組的細胞經(jīng)過成骨誘導后，剛開始產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)的時間不同。第5代的ADSCs出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)的時間最早，成骨誘導2周就可有礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)，而第15代的細胞在誘導至第3周時才于細胞密集區(qū)看到少量的礦化結(jié)節(jié)。在相同的誘導時間下，隨傳代次數(shù)的增加，細胞形成礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸減少，且體積相應(yīng)變小。茜素紅半定量檢測細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積，成骨誘導1周后，第5、10、15代的ADSCs細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積量無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，當誘導至第2周，第5代成骨誘導組細胞的鈣鹽沉積量大于第10、15代誘導組，而第10代和第15代之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。誘導至第3、4周，兩兩組間比較，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。染色實驗結(jié)合定量分析的結(jié)果表明，隨著傳代次數(shù)的增加，ADSCs成骨分化的能力減弱。學者們認為，體外擴增易導致細胞分子水平發(fā)生變化，而這種變化引起細胞增殖和分化能力的降低[16]。

圖1 兔ADSCs的形態(tài)(倒置顯微鏡 ×100) a.原代ADSCs培養(yǎng)第7天 b.第3代ADSCs培養(yǎng)第5天圖2 成脂誘導3周油紅O染色結(jié)果(倒置顯微鏡 ×200) a.成脂誘導組形成的脂肪空泡(→) b.脂肪空泡被油紅O染色圖3 成骨誘導4周茜素紅染色結(jié)果(倒置顯微鏡 ×100) a.第5代組 b.第10代組 c.第15代組圖4 茜素紅半定量檢測細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積圖5 β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老(→，倒置顯微鏡 ×100) a.第5代組 b.第10代組 c.第15代組圖6 兔ADSCs衰老率檢測*P<0.05，**P<0.01 第15代：第5代；ΔΔP<0.01 第15代：第10代

Fig1 Morphologies of rabbit ADSCs (Inverted microscope ×100) a. ADSCs of primary culture at 7 days. b. ADSCs of the third passage at 5 days.Fig2 Results of oil red O staining after adipogenic induction at 3 weeks (Inverted microscope，×200) a. formation of lipid vesicles in the adipogenic induction group (→). b. lipid vesicles stained by oil red O.Fig3 Results of alizarin red staining after osteogenic induction at 4 weeks (Inverted microscope ×100) a. the 5th passage group. b. the 10th passage group. c. the 15th passage group.Fig4 Extracellular matrix calcium mineralization detected by semiquantitative analysis of alizarin red.Fig5 Cell senescence detected by β-galactosidase stain (Inverted microscope ×100). a. the 5th passage group. b. the 10th passage group. c. the 15th passage group.Fig6 Detection of rabbit adipose-derived stem cells senescent rate.*P<0.05，**P<0.01 the 15th passage∶ the 5th passage；ΔΔP<0.01 the 15th passage∶ the 10th passage.

在細胞衰老的檢測實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，隨著體外傳代擴增，細胞的形態(tài)由典型的長梭形發(fā)展成大而扁平的不規(guī)則形態(tài)，相同視野下被β-半乳糖苷酶染色的衰老細胞所占的比例逐漸升高，說明經(jīng)過長期傳代，兔ADSCs發(fā)生衰老的程度增強。探究細胞發(fā)生衰老的原因，學者們認為，主要和端粒長度、氧化應(yīng)激和一些衰老相關(guān)基因的表達有關(guān)[17]。因此，衰老相關(guān)基因的高表達，可能在細胞的體外復(fù)制衰老中起到不可忽視的作用。

一項最新的研究結(jié)果表明，間充質(zhì)干細胞發(fā)生衰老的過程不僅影響獲得細胞的數(shù)量，同時也改變它們自我更新和多向分化的能力[18]。在骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived stem cells, BMSCs)的研究中學者們發(fā)現(xiàn),衰老的BMSCs其成骨和成脂的分化能力均是降低的[19-21]。隨后，研究者們通過實驗證實，正是由于基因表達的改變，才導致了衰老BMSCs的分化能力發(fā)生變化[22]。雖然ADSCs與BMSCs具有相似的生物學特性，但是目前關(guān)于衰老ADSCs多向分化能力的研究卻鮮有報道。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，隨體外細胞大量傳代擴增，兔脂肪干細胞成骨分化的能力下降，發(fā)生衰老的程度加大，但ADSCs成骨分化能力的下降與細胞復(fù)制衰老之間的相關(guān)性及機制有待我們更深入地研究。

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Effectofamplifiablecultivationinvitroonsenescenceandosteogenesisofrabbitadipose-derivedstemcells

ZHANGTian-yuan,GUOShu,YUYan-qiu,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,FirstAffiliatedHospitalofChineseMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

ObjectiveTo study the effect of amplifiable cultivation in vitro on senescence and osteogenesis of rabbit adipose-derived stem cells.MethodsRabbit adipose-derived stem cells were isolated from rabbits. The 5th, 10th and 15th passage of cells were harvested for the Alizarin red stained and β-galactosidase stained to compare the osteogenesis and cell senescence among different passage cells, respectively.ResultsThose cells of early passages had mineralized nodules earlier, which the nodules were the most and largest than the late passages cells. The extracellular matrix calcium mineralization decreased and the senescent cells accounted for an increasing proportion with the increase of cell passages，and the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionWith the amplification in vitro, the abilities to induce osteogenic differentiation are reduced and the degree of senescence increase in the rabbit adipose-derived stem cells.

Adipose-derived stem cells; Amplification; Senescence; Osteogenesis

國家自然科學基金資助項目(51272286),遼寧省自然科學基金資助項目(20102296)

110001 遼寧 沈陽,中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形外科(張?zhí)戽?，?澍，王晨超，孫 強)；中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理生理教研室(于艷秋)

張?zhí)戽?1985-),女,黑龍江齊齊哈爾人,碩士研究生.

郭 澍,110001,中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形外科,電子信箱:guoshu67@sohu.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.016

R-322;R318

A

1673-7040(2014)08-0492-04

2014-05-10)