趙震錦， 馮翠娟， 田玉樓， 陳鈺文， 張 揚

實驗研究

Cdc42在種植體納米化影響成骨細胞功能中的作用

趙震錦， 馮翠娟， 田玉樓， 陳鈺文， 張 揚

目的研究Cdc42在納米化種植體促進成骨細胞功能中的作用。方法將納米化種植體與成骨細胞聯(lián)合培養(yǎng)，通過Western Blot檢測Cdc42活性蛋白含量，以及熒光染色檢測成骨細胞內(nèi)F-actin分布，掃描電鏡觀察成骨細胞形態(tài)，MTT檢測成骨細胞增殖。結果納米化種植體使成骨細胞內(nèi)Cdc42活性蛋白含量明顯增多，Toxin B抑制后其活性明顯下降，納米化種植體表面成骨細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞骨架明顯，伸出較多偽足，采用Toxin B處理后細胞形態(tài)變圓，偽足減少。成骨細胞增殖功能隨種植體納米化而明顯增高，在Toxin B處理后下降。結論種植體粗化使Cdc42表達增加，可能通過Cdc42調(diào)節(jié)成骨細胞的黏附及增殖。

納米化種植體； Cdc42； 成骨細胞

為提高種植體支抗的穩(wěn)定性，改變鈦表面的物理形態(tài)或化學組成，將生物惰性鈦金屬改造成生物活性材料是長期以來學者們一直追尋的目標。為此，研究者采用了多種鈦種植體表面處理技術，來提高種植體與骨結合的速度和強度，如表面噴砂技術、羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)及磷酸三鈣(tricalcium phosphate, TCP)表面涂層技術、陽極氧化技術和噴砂加酸蝕表面處理技術等[1-3]。學者們[4-5]對種植體鈦片進行表面納米化處理增加其生物學活性，促進了成骨細胞的黏附、增殖及種植體的穩(wěn)定性，認為納米化材料所形成的納米級孔隙更加有利于成骨細胞絲足及偽足的附著，但對于其內(nèi)在信號通路機制未進行深入探討。研究結果顯示,種植體表面粗化對成骨細胞的細胞骨架有影響[5-6]，而Cdc42在多種細胞中通過細胞骨架調(diào)節(jié)細胞的黏附[7-8]，為此筆者對Cdc42/細胞骨架在種植體納米化調(diào)節(jié)成骨細胞功能的機制中的作用進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 實驗材料：人成骨肉瘤細胞系MG63，購自北京基礎醫(yī)學細胞中心，種植體材料由東北大學材料電磁過程研究教育部重點實驗室佟偉平惠贈并進行表面粗化。實驗前均常規(guī)超聲清洗、烘干、濕熱法消毒。實驗試劑：MEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，MTT試劑(美國AMRESCO公司)，Triton-100(0.2%)和TRITC-labeled phalloidin(美國SIGMA公司)。

1.2 實驗分組 共分3組。對照組(C組)：成骨細胞與光滑種植體鈦片聯(lián)合培養(yǎng)；納米化組(N組)：成骨細胞與納米化的種植體鈦片聯(lián)合培養(yǎng)；Toxin B組(T組)：成骨細胞采用Toxin B處理3 h后再與表面納米化的種植體鈦片聯(lián)合培養(yǎng)。

1.3 觀察Cdc42活性蛋白表達 聯(lián)合培養(yǎng)4 h后，收集成骨細胞，用1%NP- 40緩沖液裂解細胞，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，收集上清液中加入結合GST-p21-PAK融合蛋白的谷胱甘肽Sepharose 4B瓊脂糖珠，旋轉(zhuǎn)混合儀上4 ℃過夜用于沉淀活化的Cdc42，加熱變性，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、抗體結合及化學發(fā)光顯色，使用兔抗Cdc42多克隆抗體(P1)進行Western Blot，檢測各組種植體表面成骨細胞內(nèi)Cdc42活性蛋白的表達，采用Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達量。

1.4 觀察Cdc42對F- actin的影響 聯(lián)合培養(yǎng)4 h后甲醛固定，Triton X-100室溫透膜，TRITC標記的鬼筆環(huán)肽37°染色30 min，熒光顯微鏡觀察肌動蛋白分布。

1.5 觀察Cdc42對成骨細胞在種植體表面的形態(tài)及增殖黏附的影響 聯(lián)合培養(yǎng)4 h后5%戊二醛固定，掃描電鏡觀察成骨細胞的形態(tài)改變； 在1、4、7 d分別棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml) 4 h，吸凈MTT，加入150 μl DMSO，輕輕震蕩10 min，使用酶標儀490 nm波長下測吸光度值(A)。重復實驗3次。

2 結果

2.1 納米化種植體對成骨細胞內(nèi)Cdc42活性蛋白含量的影響 在納米化種植體表面的成骨細胞內(nèi)Cdc42活化水平明顯增高，而Toxin B預處理部分抑制Cdc42活化(圖1)。

2.2 Cdc42對納米化種植體表面成骨細胞形態(tài)及肌動蛋白濃聚的影響 納米化種植體表面成骨細胞伸展，偽足形成，肌動蛋白聚合，Toxin B預處理后肌動蛋白聚合減少，細胞形態(tài)變圓，偽足減少，顯示Cdc42可能參與這個過程(圖2)。

2.3 Cdc42對成骨細胞在種植體表面增殖的影響 在復合培養(yǎng)5 d后，納米化種植體表面細胞黏附增殖水平明顯高于對照組，Toxin B處理后細胞黏附增殖水平降低。這說明，移植料表面成骨細胞黏附增值水平隨培養(yǎng)時間延長而增高。見表1。

3 討論

錯牙合畸形治療過程中支抗的控制非常重要，納米種植體的出現(xiàn)為正畸臨床提供了“絕對”支抗，擴大了正畸矯治的適應證[1，9-10],因此，學者們對納米種植體進行了大量研究。目前,學者們采取了多種方法如鈦漿噴涂、酸蝕、噴砂、陽極氧化等來進行種植體的表面處理[2-5，11-13]。有學者[4-5]進行各種表面處理的目標，是種植體表面的納米化，從而增加其生物學活性，促進成骨細胞的黏附、增殖及種植體的穩(wěn)定性。學者們[3，5]認為，納米化材料所形成的納米級孔隙更加有利于成骨細胞絲足及偽足的附著，但對于其內(nèi)在信號通路機制沒有進行深入探討。本研究采用納米化純鈦種植體材料進行的前期研究工作[5]已經(jīng)證明，種植體納米化對成骨細胞功能及黏附的影響，細胞骨架有所改變，但影響成骨細胞遷移細胞骨架改變的分子機制尚不清楚。

圖1 免疫沉淀Western Blot檢測Cdc42活性蛋白水平圖2 掃描電鏡觀察成骨細胞形態(tài)(SEM ×2000) a. C組 b. N組 c. T組

Fig1 Level of Cdc42 detected by Western Blot.Fig2 Morphology of osteoblast (SEM ×2000). a. Group C. b. Group N. c. Group T.

表1 各組成骨細胞黏附增殖測定結果

注：*與C組組間差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；#與N組組間差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05

Rho GTPase家族成員中的Racl和Cdc42對肌動蛋白細胞骨架都有其特異的生物效應，我們先期的研究成果表明[7]，受到外界刺激后，細胞骨架改變定向遷移主要涉及PI3K活化，通過Rac/cdc42導致肌動蛋白聚合，使細胞發(fā)生定向遷移及黏附。因此，我們檢測了Cdc42在納米化種植體促進成骨細胞黏附及調(diào)節(jié)功能過程中的作用。本研究中，我們證實Cdc42是參與納米化種植體調(diào)節(jié)成骨細胞功能及黏附的信號分子。結果顯示，納米化種植體表面活性Cdc42蛋白水平增高。Rho GTPases通過活性(GTP結合)及非活性(GDP結合)形式之間的轉(zhuǎn)換，控制細胞生理過程，扮演“分子開關”的角色[7-8]?；钚訡dc42含量的增高，支持了Cdc42在納米化種植體調(diào)節(jié)成骨細胞功能機制參與的可能性。

細胞骨架的形態(tài)反應了細胞與種植體表面結合的能力，在種植體經(jīng)過表面處理且增加生物學活性后，其表面細胞通常伸展，形態(tài)不規(guī)則，偽足增加[13-15]。我們的結果顯示也如此，但將成骨細胞采用Cdc42拮抗劑Toxin B處理后，細胞在納米化種植體表面黏附能力減弱，細胞形態(tài)近似圓形，偽足減少，說明Cdc42可能影響成骨細胞向種植體表面的遷移及黏附，Cdc42/Actin信號轉(zhuǎn)導通路在種植體表面成骨細胞吸附和遷移的過程中扮演重要角色。同樣，成骨細胞采用Cdc42拮抗劑Toxin B處理后，成骨細胞在納米化種植體表面的增殖能力明顯降低，顯示Cdc42參與納米化種植體調(diào)節(jié)成骨細胞增殖功能的機制[15]。

目前，對納米種植體的臨床應用研究較多，對其骨結合的內(nèi)在機制研究較少。通過進行相關研究，以了解Cdc42/Actin信號轉(zhuǎn)導通路對成骨細胞遷移、黏附的影響，有利于促使種植體骨整合，提高種植體的成功率，使之在正畸臨床中能更加有效地發(fā)揮作用。

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RoleofCdc42infunctionofosteoblastonnano-phasetitaniumimplantmaterials

ZHAOZhen-jin,FENGCui-juan,TIANYu-lou,etal.

(DepartmentofOrthodontic,SchoolofStomatology,ChinaMedicalUniversity,LiaoningInstituteofDentalResearch,Shenyang110002,China)

ObjectiveTo investigate the role of Cdc42 in osteoblast function on nanophase-implant.MethodsThe osteoblast-like cell line MG63 was cultured on normal/nano-phase implants. The levels of activated Cdc42 were measured by the GTPase activity pull-down assay and western blot. Changes of actin cytoskeleton and morphological characteristics were observed by confocal laser scanning microscope (CLSM) and scanning electron microscope (SEM) respectively. Cell proliferation was detected by MTT.ResultsThe activation level of Cdc42 was increase when cultured on nano-phase implant and blocked by Toxin B treatment. The shape of osteoblast attached on implant was irregular with extended pseudopodium. After treated with Toxin B, the shape of cell tended to be round and pseudopodium decreased. The proliferation of osteoblast was increased when cultured on nano-phase implant but decreased after pretreatment by Toxin B.ConclusionNano-phase implant could increase the impression of active Cdc42. Nano-phase implant might improve the proliferation and inhesion of osteoblast through Cdc42.

Nano- phase implant; Cdc42; Osteoblast

遼寧省科學技術計劃基金資助項目(200925010-29)

110002 遼寧 沈陽,中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 口腔正畸科

趙震錦(1975-)，女，遼寧黑山人，副教授，副主任醫(yī)師，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.017

R329.2

A

1673-7040(2014)08-0496-03

2014-03-21)