劉麗麗, 楊檸澤, 張延潔, 王志軍

實(shí)驗研究

低氧對肌腱細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響

劉麗麗, 楊檸澤, 張延潔, 王志軍

目的探討低氧對肌腱細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。方法酶消化法分離得到的肌腱細(xì)胞分別在低氧(2%O2)和常規(guī)氧濃度(21%O2)下進(jìn)行培養(yǎng)，第1代肌腱細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜檢測，并用RT-PCR對其中4個差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證。結(jié)果低氧培養(yǎng)組與常規(guī)氧濃度組相比，有40個基因表達(dá)差異，且全部在低氧組表達(dá)上調(diào)。選取的4個差異表達(dá)基因的RT-PCR的驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。結(jié)論低氧促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖涉及多個基因參與。

低氧； 肌腱細(xì)胞； cDNA芯片； 基因表達(dá)譜

肌腱細(xì)胞是最早用于構(gòu)建組織工程肌腱的種子細(xì)胞；它來源于肌腱，構(gòu)建出的組織在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面，與正常肌腱更加相似。但是由于取材面積較小分離得到的肌腱細(xì)胞數(shù)量有限，且作為終末分化細(xì)胞，肌腱細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖相對緩慢，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞表型逐漸消失，分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力下降，所以如何促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖和維持其表型、功能，是肌腱組織工程的一個重要研究內(nèi)容。目前，除了常用的添加生長因子(IGF-Ⅰ、BMPs、bFGF、PDGF等)、施加力學(xué)刺激或應(yīng)用富含血小板的血漿(platelet rich plasma-clot release, PRCR)等方法外[1-3]，低氧培養(yǎng)也越來越受到重視。目前的研究表明，低氧培養(yǎng)可以明顯促進(jìn)肌腱(干)細(xì)胞增殖[4-5〗，但對其促增殖的機(jī)制尚缺乏充分的認(rèn)識?？紤]到細(xì)胞增殖是一個涉及多基因、多水平調(diào)控的過程，因此，自2012年始，筆者研究采用表達(dá)譜芯片這一常用的高通量檢測技術(shù)，對低氧培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞進(jìn)行檢測分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物與主要試劑

新生1周左右的小豬3只，購自上海市甲干實(shí)驗動物中心。 DMEM培養(yǎng)液(美國HYCLONE公司)；青霉素-鏈霉素溶液和胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；膠原酶(德國SERVA公司)；胎牛血清(BioWest，BioSun)； CO2培養(yǎng)箱(美國THERMO FORMA公司)；低氧培養(yǎng)箱(德國BINDER公司)。

1.2 方法

1.2.1 肌腱細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng) 無菌條件下取新生小豬后足趾深屈肌腱，修除腱周組織后將肌腱剪碎，置于0.2%膠原酶NB4中37 ℃振蕩消化，接種于培養(yǎng)皿(此即原代P0)，置于低氧培養(yǎng)箱(2%O2，實(shí)驗組)或常規(guī)的CO2培養(yǎng)箱(21% O2，對照組)培養(yǎng)并傳代；P1用于芯片分析和RT-PCR檢測。

1.2.2 總RNA提取、純化和芯片檢測 所用芯片為NimbleGen豬表達(dá)譜芯片(美國ROCHE NIMBLEGEN公司)，由北京博奧生物有限公司進(jìn)行芯片檢測，大致流程如下：Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA并進(jìn)行純化Cy3標(biāo)記，與芯片42 ℃雜交過夜。NimbleGen MS 200 Microarray Scanner掃描獲取熒光信號強(qiáng)度值，NimbleScan 2.6軟件進(jìn)行圖像分析。芯片顯著性分析(significance analysis of microarrays, SAM)R程序包進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。差異倍數(shù)>2，且q≤ 5%(q值表示該基因被判斷為差異基因時的錯誤發(fā)現(xiàn)率，類似于P值。差異越顯著，q值越小)的基因認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

1.2.3 RT-PCR驗證 按總RNA提取試劑盒操作步驟，提取實(shí)驗組和對照組P1的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行以下基因的擴(kuò)增驗證：IGF2(insulin-like growth factor 2)、IGFBP3(insulin-like growth factor binding protein 3)、TN-X(tenascin-X)、RERG(ras-like, estrogen-regulated, growth inhibitor)和β-actin(內(nèi)參)。各基因引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。

表1 RT-PCR引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小

Tab1 RT-PCR primer sequences, annealing temperature and product size

基因引物序列(5'-3')退火溫度/℃產(chǎn)物大小(bp)IGF2F:ACACCCTCCAGTTTGTCTGCG65109R:CAGCTACGGAAGCAGCACTCTIGFBP3F:GGCATCCACATCCCCAACT58145R:CCCCTTTCCCCTTCACGTN-XF:CCCATAGAGCCCGTTGAGGT65532R:GGACTGTGGGGAGGAGATGCRERGF:ATGGCTAAAAGTGCGGAGGT53600R:CTAACTACTGATTTTGGTGAβ-actinF:CCACCGCAAATGCTTCTAG60208R:GCTGTCACCTTCACCGTTCC

注：F表示Forward(正向引物)，R表示Reverse(反向引物)

2 結(jié)果

2.1 RNA抽提質(zhì)量檢測

6個樣本的RNA A260/280為1.80～2.05；經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測，RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1。RNA純度、總量及完整性均符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗要求。

2.2 芯片雜交質(zhì)量判定

芯片雜交信號均一；Alignment Oligo的雜交信號值正常，表明雜交反應(yīng)成功；STC結(jié)果表明，樣品雜交過程不存在交叉污染。

2.3 差異表達(dá)基因

芯片檢測結(jié)果顯示，低氧條件下培養(yǎng)的P1與常規(guī)氧濃度組相比，有40個基因表達(dá)差異,且全部在低氧組表達(dá)上調(diào)(表2)。

2.4 RT-PCR驗證

凝膠電泳結(jié)果顯示，低氧組IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG的表達(dá)，均不同程度地高于常規(guī)氧濃度組(圖1)，與基因芯片檢測結(jié)果相符。

圖1 RT-PCR檢測IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG的表達(dá)

Fig1 RT-PCR detection of the expression of IGF-2, IGFBP-3, TN-X and the RERG.

3 討論

迅速擴(kuò)增肌腱細(xì)胞并維持其表型，一直是肌腱組織工程研究的內(nèi)容之一?？紤]到肌腱是一種少血管的致密結(jié)締組織，我們推測，其生理環(huán)境應(yīng)該是低氧狀態(tài)，因此，我們的前期研究使用了2%O2培養(yǎng)肌腱細(xì)胞，結(jié)果表明，低氧可以明顯促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖和維持其表型功能。近年來，越來越多的研究均使用低氧培養(yǎng)各種類型的細(xì)胞，多數(shù)研究結(jié)果顯示，低氧可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]，但關(guān)于促增殖的機(jī)制研究相對較少，且多為短期培養(yǎng)細(xì)胞(3～72 h)增殖的機(jī)制研究[7]。由于構(gòu)建組織需要大量的種子細(xì)胞，所以培養(yǎng)時間至少要1周以上，因此，我們對培養(yǎng)時間至少1周的第1代肌腱細(xì)胞，進(jìn)行了表達(dá)譜芯片的檢測，以尋找較長時間低氧濃度促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖的有關(guān)基因，以便為深入研究機(jī)制打下基礎(chǔ)。

芯片檢測結(jié)果顯示,有40個基因表達(dá)發(fā)生改變，與其他研究結(jié)果相比，本研究檢測到的差異表達(dá)基因數(shù)目較少。我們推測，其主要原因可能在于低氧持續(xù)時間的不同。如上所述，低氧培養(yǎng)細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究，多為短期培養(yǎng)的細(xì)胞，處于低氧早期的細(xì)胞應(yīng)該有大量的基因表達(dá)改變，以適應(yīng)低氧環(huán)境。而隨著低氧時間的延長，細(xì)胞已進(jìn)入適應(yīng)期，因此表達(dá)改變的基因數(shù)目會下降。此外，細(xì)胞類型和低氧濃度的不同，也可能是研究結(jié)果差異的原因。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，40個差異表達(dá)基因中，部分基因與細(xì)胞增殖凋亡有關(guān)，我們選取的4個RT-PCR驗證基因IGF-2、IGFBP-3、TN-X和RERG，也涉及影響細(xì)胞的增殖或凋亡。

IGFBP-3是IGFBPs蛋白家族的成員。它可以結(jié)合體內(nèi)90%以上的IGF-1，也可以結(jié)合IGF-2，通過形成復(fù)合物而延長IGFs的半衰期。IGFs具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，但I(xiàn)GFBP-3在不同的細(xì)胞微環(huán)境中，具有不同的功能，即促進(jìn)細(xì)胞增殖或促進(jìn)細(xì)胞凋亡；在同樣的細(xì)胞內(nèi)，也可以作為抑制因子或刺激因子發(fā)揮不同的作用[8]。本研究的芯片檢測結(jié)果顯示，IGF-1表達(dá)無明顯改變，而低氧組IGF-2和IGFBP3表達(dá)上調(diào)。因此，該3種因子在低氧促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖過程中的作用機(jī)制，需要深入研究。

表2 40個差異表達(dá)基因(低氧培養(yǎng)組表達(dá)上調(diào))

注：根據(jù)差異倍數(shù)從大到小排序

Tenascin-X(TN-X)屬于tenascin蛋白家族，除了TN-X以外，還有TN-C, TN-R和TN-W，均是細(xì)胞外基質(zhì)成分。TN-X在肌腱、韌帶和周圍神經(jīng)高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),TN-X與骨骼肌、心臟等多種組織發(fā)育有關(guān)，其缺失可導(dǎo)致膠原密度下降[9]。另外有研究結(jié)果顯示，TN-X可以與VEGF結(jié)合并協(xié)同作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[10]。低氧可以促進(jìn)血管生成，我們的芯片檢測結(jié)果顯示，低氧組TN-X表達(dá)上調(diào)，可能與促血管生成有關(guān)。但TN-X是否還與肌腱細(xì)胞增殖直接相關(guān)，尚需深入研究。

RERG是一個在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的基因，該基因與ras相關(guān)且受雌激素調(diào)節(jié)，主要起抑制細(xì)胞增殖和分化的作用。從RERG抑制細(xì)胞增殖的角度看，與本研究低氧組RERG表達(dá)上調(diào)而低氧又促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖的結(jié)果相矛盾，因此，該基因在低氧促進(jìn)肌腱細(xì)胞增殖過程中究竟有何作用，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過表達(dá)譜芯片的檢測和RT-PCR的驗證發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)氧濃度培養(yǎng)組相比，低氧條件下培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞部分基因表達(dá)上調(diào)，其中一些基因和細(xì)胞增殖凋亡有關(guān)。

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Effectofhypoxiaonthegeneexpressionprofilingoftenocytes

LIULi-li,YANGNing-ze,ZHANGYan-jie,etal.

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,XinhuaHospital,DalianUniversity,Dalian116021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia on the gene expression profiling of tenocytes.MethodsTenocytes were isolated by enzymatic digestion and cultured in hypoxic (2%O2) or normoxic (21%O2) condition. Tenocytes gene expression profiling of Passage 1 were analyzed by cDNA microarray, and the selected four differentially expressed genes expressions were verified by RT-PCR.ResultsThere were 40 differences on gene expression between hypoxic and normoxic tenocytes, and all of which were up-regulated in hypoxic group. RT-PCR validation was consistent with microarray results.ConclusionMultiple genes were involved in tenocytes proliferation under hypoxia.

Hypoxia; Tenocytes; cDNA microarray； Gene expression profiling

國家自然科學(xué)基金資助項目(81101447)

116021 遼寧 大連，大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 整形外科(劉麗麗,楊檸澤,王志軍)；昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系(張延潔)

劉麗麗(1985-)，女，黑龍江牡丹江人，碩士研究生.

王志軍，116021，大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 整形外科，電子信箱：wzy618@tom.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.018

R318

A

1673-7040(2014)08-0499-04

2014-04-21)