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        青葙子苷A對AHNP誘導肝損傷的保護作用研究

        2014-10-28 10:05:17李洪亮程齊來孫立波黃志勤
        湖北農(nóng)業(yè)科學 2014年15期
        關(guān)鍵詞:肝損傷

        李洪亮+程齊來+孫立波+黃志勤

        摘要:為研究青葙子苷A對大鼠急性出血性壞死性胰腺炎(AHNP)誘導肝損傷的治療作用及其初步作用機制,應用逆行胰膽管術(shù)注射牛磺膽酸鈉(TAC)復制了AHNP試驗動物模型,將其分為假手術(shù)組(A組)、AHNP生理鹽水對照組(B組)、AHNP青葙子苷A高、低劑量治療組(C、D組)和AHNP奧曲肽治療組(陽性藥物對照,E組)。各組試驗動物手術(shù)后6 h處死,測定腹水量,運用比色法檢測其血清淀粉酶含量,ELISA法測定肝組織中TNF-α含量,HE染色觀察其肝組織病理變化,透射電鏡觀察肝臟卵圓細胞形態(tài)變化,Western-Blot檢測肝組織中細胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-кB)蛋白的表達情況。結(jié)果表明,與A組比較,AHNP生理鹽水對照組(B組)大鼠肝組織中腹水量、血清淀粉酶含量、TNF-α含量明顯升高,NF-кB蛋白表達明顯增強;青葙子苷A治療組(C、D組)和奧曲肽治療組(E組)肝組織中腹水量、血清淀粉酶含量、TNF-α含量及NF-кB蛋白表達均較B組顯著(P<0.05)降低。說明青葙子苷A對AHNP誘導的肝損傷有顯著的保護作用,其機制可能是通過抑制胰彈性蛋白酶的分泌與激活,抑制NF-кB表達,降低炎癥反應,從而減輕肝損傷。

        關(guān)鍵詞:青葙子苷A;急性出血性壞死性胰腺炎(AHNP);NF-кB;肝損傷

        中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)15-3588-03

        Protective Effects of Celosin-A on the AHNP-induced Liver Injury

        LI Hong-liang1, CHEN Qi-lai1,2, SUN Li-bo3,HUANG Zhi-qin1

        (1. School of Pharmacy, Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi, China;2. Hunan University of Chinese Medicine,

        Changsha 410208, China; 3.Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao 266001, Shandong, China)

        Abstract: The therapeutical effect of Celosin-A on liver injury of rats caused by acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis(AHNP) were investigated and the potential mechanism of AHNP animal was studied by injecting TAC with retrograde cholangiopancreatography divided into five groups including sham operation group (A), AHNP saline control group(B group), treatment group in high and low dosage of Celosin-A (C and D group), AHNP control group treated with Octreotide (E group, positive drug control). All animals in each group were executed after 6h of surgery and measured its volume of ascites, content of serum amylase, TNF-α content in liver tissue with colorimetry and ELSIA method. The liver pathological changes were observed by HE dye. The hepatic oval cells morphology was observed under transmission electron microscope. The expression of NF-кB were detected by Westeen-Blot method. The results showed that the volume of ascites, content of serum amylase and TNF-α in AHNP saline control group(B group) were obviously higher than those in group A. The expression of NF-кB was obviously strengthened. Compared with AHNP saline control group(B group) the volume of ascites, content of serum amylase and TNF-α ,NF-кB expression -in group C, D and E were all significantly lower(P<0.05). It is indicated that the Celosin-A had significant protective effect on AHNP-induced liver injury. Liver injury might be alleviated through inhabiting the activation and secretion of pancreatic elastase to inhabit the expression of NF-кB and reduce inflammation.endprint

        Key words: celosin-A; acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis; NF-кB; liver injury

        收稿日期:2014-02-19

        基金項目:江西省自然科學基金項目(2012ZBAB205006);江西省教育廳科技計劃項目(GJJ13676);贛南醫(yī)學院院級資助項目(YB201205)

        作者簡介:李洪亮(1983-),男,江西贛州人,講師,主要從事藥理學研究,(電話)18970786132(電子信箱)zhonglishidatou@126.com;通訊作者,

        黃志勤,副教授,碩士生導師,主要從事天然藥物學研究,(電子信箱)zhonglishidatou@126.com。

        青葙子(Semen celosiae)為莧科植物青葙(Celosia argentea L.)的干燥成熟種子,主要分布于江西、福建、廣東等地。青葙子是一味常用中藥,性苦微寒,歸肝經(jīng),具有清熱瀉火,明目退翳之功效,常用于目赤腫痛、角膜炎、角膜云翳、虹膜睫狀體炎、眩暈、皮膚風熱瘙癢、疥癬等的治療[1]?,F(xiàn)代研究表明,青葙子主要的活性成分為五環(huán)三萜及其苷類(青葙子苷A、青葙子苷B、齊墩果酸等)、谷甾醇、棕櫚酸、豆甾醇等[2]。青葙子苷A具有良好的保肝、抗氧化及抗腫瘤功能[3-5]。急性出血性壞死性胰腺炎(AHNP)是一種級聯(lián)炎癥反應,起病急,病情兇險,發(fā)展快,且多合并心、肺、腎、肝等多臟器的功能不全甚至衰竭,病死率高,肝臟是最常受累的器官之一[6]。本試驗通過對比觀察?;悄懰徕c(TAC)誘導的大鼠AHNP模型以及使用青葙子苷A治療后模型中細胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-кB)、血清淀粉酶(AMY)、肝組織中TNF-α及腹水量的變化,初步探討了青葙苷A對AHNP合并肝損傷的治療作用及機制。

        1 材料與方法

        1.1 試驗動物與主要試劑

        雄性SD大鼠50只購自江西中醫(yī)學院實驗動物中心,體重200~250 g,合格證號:2013016。奧曲肽注射液,諾華制藥公司;NF-κB(P65)轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒,普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;Trizol液,Progema公司(中國,香港);青葙子苷A,南昌萬特生物制品有限公司,批號:WT20120931。

        1.2 方法

        1.2.1 動物分組及模型制備 青葙子苷A受試溶液配制:用20倍稀釋的DMSO溶液配制成1 mg/mL注射液備用。動物分組:50只雄性SD大鼠隨機均分為5組,每組10只。①假手術(shù)對照組(A組);②AHNP生理鹽水對照組(B組);③AHNP+青葙子苷A高、低劑量治療組(C、D組);④AHNP+奧曲肽治療組(E組)。除A組外的40只大鼠采用?;悄懰徕c逆行胰膽管注射復制AHNP試驗模型,劑量為5%的?;悄懰徕c0.1 mL/100 g,持續(xù)1 min,滯留4 min。手術(shù)后2、5、8、11 h,奧曲肽治療組分次背部皮下注射奧曲肽注射液(100 μg/100 mL),劑量為15 μg/kg體重;青葙子苷A治療組分別注射高劑量(5.0 mg/kg體重,C組)、低劑量(2.5 mg/kg體重,D組)青葙子苷A溶液;AHNP生理鹽水對照組(B組)注射等體積生理鹽水。A組開腹翻動腸管后關(guān)腹造成簡單的外科損傷,B、C、D、E組大鼠于注射完藥物6 h后,留取靜脈血和肝標本待測。

        1.2.2 生化指標檢測 ①碘-淀粉比色法測定各組大鼠血清淀粉酶含量;②ELISA法測定各組大鼠肝組織中TNF-α含量;③測定各組大鼠腹水量(mL)。

        1.2.3 蘇木精-伊紅染色 取大鼠部分肝組織固定于4%甲醛中,石蠟包埋,切片,HE染色,觀察肝組織病理變化。

        1.2.4 透射電鏡觀察卵圓細胞 固定于4%戊二醛中的肝組織常規(guī)環(huán)氧樹脂Epon618包埋,電鏡下觀察增生的卵圓細胞形態(tài)變化。

        1.2.5 Western-Blot檢測試驗各組NF-кB蛋白表達水平 用BCA法進行細胞總蛋白濃度定量,取50 μg總蛋白用10%或6% SDS-PAGE電泳分離,半干法或濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上,5%脫脂牛奶4 ℃封閉過夜。分別用一抗NF-кB抗體4 ℃孵育過夜;HRP標記的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育1 h,化學發(fā)光法顯影,β-actin為內(nèi)參照,以目的蛋白與內(nèi)參照的灰度比值為結(jié)果,用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

        1.2.6 統(tǒng)計學處理 試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行t檢驗及方差分析,以P<0.05為差異有顯著意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 血清淀粉酶含量、肝組織TNF-α含量及腹水量的變化

        由表1可見,B組淀粉酶和TNF-α含量均極顯著高于A組(P<0.01)。C、D、E組淀粉酶及TNF-α含量均顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)低于B組,但仍明顯高于A組。試驗各組腹水量比較,A組大鼠未見腹水積聚,B組大鼠術(shù)后6 h腹水量較多,C、D、E組大鼠6 h腹水量較B組明顯減少。

        2.2 肝組織HE病理切片

        由圖1可見,A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細胞排列整齊,肝細胞形態(tài)正常。B組大鼠肝細胞氣泡樣變性,肝細胞邊界不清,胞漿呈顆粒狀;部分大鼠肝組織匯管區(qū)內(nèi)可見炎性細胞浸潤,小葉周邊的肝細胞發(fā)生嗜酸性變性,并可見濃縮的凋亡小體。C、D、E組大鼠肝組織病變較B組明顯減輕。

        2.3 電鏡觀察試驗各組大鼠卵圓細胞生長變化情況

        肝細胞與卵圓細胞比較在形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)方面存在顯著區(qū)別:①卵圓細胞呈圓形或橢圓形而肝細胞呈多邊形;②卵圓細胞體積較小,約為肝細胞的1/3~l/5;③卵圓細胞核大,嗜堿性強,胞質(zhì)少,核漿比例較大。病理狀態(tài)下顯示:輕度肝損傷可見卵圓細胞沿匯管區(qū)膽管上皮依次排列有序生長;隨著損傷加重,卵圓細胞增生由匯管區(qū)伸入肝小葉,與肝細胞混雜生長。由圖2可見,A組卵圓細胞生長速度較快且排列整齊;B組的生長速度明顯較A組慢且排列無規(guī)律,與肝細胞混雜生長,部分細胞出現(xiàn)水腫壞死;C、D、E組卵圓細胞與B組相比明顯排列有序并且生長速度明顯增快。endprint

        2.4 試驗各組NF-кB蛋白表達的變化

        由圖3、圖4可見,A組NF-кB少量表達;B組NF-кB蛋白表達較A組顯著(P<0.05)升高;C、D組NF-кB蛋白表達較B組顯著降低(P<0.05),但仍高于A組的表達;E組NF-кB蛋白表達與B組相比有所降低,但無顯著差異。

        3 小結(jié)與討論

        本研究采用?;悄懰徕c逆行胰膽管注射復制AHNP大鼠模型,病理組織切片結(jié)果表明,當AHNP發(fā)生時可誘導肝細胞氣泡樣變性,肝細胞邊界不清,胞漿呈顆粒狀,部分大鼠肝組織匯管區(qū)內(nèi)可見炎性細胞浸潤,小葉周邊的肝細胞發(fā)生嗜酸性變性,并可見濃縮的凋亡小體;透射電鏡觀察肝損傷可見卵圓細胞沿匯管區(qū)膽管上皮依次排列有序生長,隨著損傷加重,卵圓細胞增生由匯管區(qū)伸入肝小葉,與肝細胞混雜生長,經(jīng)過青葙子苷A治療后卵圓細胞生長較AHNP模型組明顯排列有序且生長速度明顯增快,并且比色法測定試驗各組的血清淀粉酶含量、ELISA法測定肝組織中TNF-α含量及腹水量檢測結(jié)果也表明青葙子苷A能明顯減輕AHNP誘導的肝組織損傷。大量研究表明,AHNP時多器官功能不全(MODS)和全身炎性反應綜合征(SIRS)與白細胞過度活化和炎性細胞因子大量釋放密切相關(guān),但對于其上游途徑即AHNP時如何導致炎性細胞因子釋放與白細胞活化則仍不清楚。目前認為,胰酶的過早激活對于AHNP的發(fā)病是最直接的因素。胰彈性蛋白酶在胰腺外炎性細胞因子的產(chǎn)生過程中起主要作用,在胰腺的局部炎癥與胰外器官損害全身炎癥反應的發(fā)生之間起重要的作用[7]。近來研究表明,NF-кB是廣泛存在于細胞中具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,它能參與多種炎癥細胞因子的過度表達,參與多種疾病過程[8-11]。腹腔內(nèi)注射胰彈性蛋白酶在30 min內(nèi)即可激活NF-кB,表明急性胰腺炎(AP)病程與NF-кB活化密切相關(guān)。本研究運用Western-Blot檢測試驗各組NF-кB蛋白表達水平,結(jié)果表明經(jīng)過青葙子苷A治療后能夠明顯抑制AHNP誘導的肝組織損傷時NF-кB蛋白的表達,但青葙子苷A究竟通過何種途徑抑制NF-кB的核活性和轉(zhuǎn)位,其具體機制有待進一步的研究探討。

        參考文獻:

        [1] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005.137.

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        [3] VETRIEHELVAN T,JEGADEESAN M,DEVI B A.Anti-diabetie activity of alcoholic extract of Celosia argentea Linn. seeds in rats[J].Biol Pharm Bull,2002,25(4):526-528.

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        [5] 陳會敏,張 靜,胡志芳,等.熊果酸誘導胃癌細胞BGC-823凋亡機制的研究[J].武漢大學學報(醫(yī)學版),2006,27(3):299-302.

        [6] 吳之浩,盧根林,鄧 勇. 硫化氫對急性出血壞死性胰腺炎患者凝血功能的影響[J].中國鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2012,23(15):52-53.

        [7] 張 昭,趙 剛,王 丹,等.生長抑素對急性出血壞死性胰腺炎肝損傷的作用機制[J].中國普通外科雜志,2008,17(3):224-227

        [8] TIAN J,YAN J ,WANG W,et al. T-2 toxin enhances catabolic activity of hypertrophic chondrocytes through ROS-NF-kB-HIF-2α pathway[J].Toxicology in Vitro,2012, 26(7): 1106-1113.

        [9] RUSHWORTH S A,BOWLES K M,BARRERA L N,et al.BTK inhibitor ibrutinib is cytotoxic to myeloma and potently enhances bortezomib and lenalidomide activities through NF-Κb[J].Cellular Signalling,2013,25(1):106-112.

        [10] VANDERMARK E R,DELUCA K A,GARDNER C R,et al.Human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins alter NF-kB in cultured cervical epithelial cells and inhibition of NF-kB promotes cell growth and immortalization[J].Virology,2012,425(1):53-60.

        [11] VENKATESWARARAO E,ANH HLE T,SHARMA V K,et al.Study on anti-proliferative effect of benzoxathiole derivatives through inactivation of NF-κB in human cancer cells[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2012,22(14):4523-4527.endprint

        2.4 試驗各組NF-кB蛋白表達的變化

        由圖3、圖4可見,A組NF-кB少量表達;B組NF-кB蛋白表達較A組顯著(P<0.05)升高;C、D組NF-кB蛋白表達較B組顯著降低(P<0.05),但仍高于A組的表達;E組NF-кB蛋白表達與B組相比有所降低,但無顯著差異。

        3 小結(jié)與討論

        本研究采用?;悄懰徕c逆行胰膽管注射復制AHNP大鼠模型,病理組織切片結(jié)果表明,當AHNP發(fā)生時可誘導肝細胞氣泡樣變性,肝細胞邊界不清,胞漿呈顆粒狀,部分大鼠肝組織匯管區(qū)內(nèi)可見炎性細胞浸潤,小葉周邊的肝細胞發(fā)生嗜酸性變性,并可見濃縮的凋亡小體;透射電鏡觀察肝損傷可見卵圓細胞沿匯管區(qū)膽管上皮依次排列有序生長,隨著損傷加重,卵圓細胞增生由匯管區(qū)伸入肝小葉,與肝細胞混雜生長,經(jīng)過青葙子苷A治療后卵圓細胞生長較AHNP模型組明顯排列有序且生長速度明顯增快,并且比色法測定試驗各組的血清淀粉酶含量、ELISA法測定肝組織中TNF-α含量及腹水量檢測結(jié)果也表明青葙子苷A能明顯減輕AHNP誘導的肝組織損傷。大量研究表明,AHNP時多器官功能不全(MODS)和全身炎性反應綜合征(SIRS)與白細胞過度活化和炎性細胞因子大量釋放密切相關(guān),但對于其上游途徑即AHNP時如何導致炎性細胞因子釋放與白細胞活化則仍不清楚。目前認為,胰酶的過早激活對于AHNP的發(fā)病是最直接的因素。胰彈性蛋白酶在胰腺外炎性細胞因子的產(chǎn)生過程中起主要作用,在胰腺的局部炎癥與胰外器官損害全身炎癥反應的發(fā)生之間起重要的作用[7]。近來研究表明,NF-кB是廣泛存在于細胞中具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,它能參與多種炎癥細胞因子的過度表達,參與多種疾病過程[8-11]。腹腔內(nèi)注射胰彈性蛋白酶在30 min內(nèi)即可激活NF-кB,表明急性胰腺炎(AP)病程與NF-кB活化密切相關(guān)。本研究運用Western-Blot檢測試驗各組NF-кB蛋白表達水平,結(jié)果表明經(jīng)過青葙子苷A治療后能夠明顯抑制AHNP誘導的肝組織損傷時NF-кB蛋白的表達,但青葙子苷A究竟通過何種途徑抑制NF-кB的核活性和轉(zhuǎn)位,其具體機制有待進一步的研究探討。

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        2.4 試驗各組NF-кB蛋白表達的變化

        由圖3、圖4可見,A組NF-кB少量表達;B組NF-кB蛋白表達較A組顯著(P<0.05)升高;C、D組NF-кB蛋白表達較B組顯著降低(P<0.05),但仍高于A組的表達;E組NF-кB蛋白表達與B組相比有所降低,但無顯著差異。

        3 小結(jié)與討論

        本研究采用牛磺膽酸鈉逆行胰膽管注射復制AHNP大鼠模型,病理組織切片結(jié)果表明,當AHNP發(fā)生時可誘導肝細胞氣泡樣變性,肝細胞邊界不清,胞漿呈顆粒狀,部分大鼠肝組織匯管區(qū)內(nèi)可見炎性細胞浸潤,小葉周邊的肝細胞發(fā)生嗜酸性變性,并可見濃縮的凋亡小體;透射電鏡觀察肝損傷可見卵圓細胞沿匯管區(qū)膽管上皮依次排列有序生長,隨著損傷加重,卵圓細胞增生由匯管區(qū)伸入肝小葉,與肝細胞混雜生長,經(jīng)過青葙子苷A治療后卵圓細胞生長較AHNP模型組明顯排列有序且生長速度明顯增快,并且比色法測定試驗各組的血清淀粉酶含量、ELISA法測定肝組織中TNF-α含量及腹水量檢測結(jié)果也表明青葙子苷A能明顯減輕AHNP誘導的肝組織損傷。大量研究表明,AHNP時多器官功能不全(MODS)和全身炎性反應綜合征(SIRS)與白細胞過度活化和炎性細胞因子大量釋放密切相關(guān),但對于其上游途徑即AHNP時如何導致炎性細胞因子釋放與白細胞活化則仍不清楚。目前認為,胰酶的過早激活對于AHNP的發(fā)病是最直接的因素。胰彈性蛋白酶在胰腺外炎性細胞因子的產(chǎn)生過程中起主要作用,在胰腺的局部炎癥與胰外器官損害全身炎癥反應的發(fā)生之間起重要的作用[7]。近來研究表明,NF-кB是廣泛存在于細胞中具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,它能參與多種炎癥細胞因子的過度表達,參與多種疾病過程[8-11]。腹腔內(nèi)注射胰彈性蛋白酶在30 min內(nèi)即可激活NF-кB,表明急性胰腺炎(AP)病程與NF-кB活化密切相關(guān)。本研究運用Western-Blot檢測試驗各組NF-кB蛋白表達水平,結(jié)果表明經(jīng)過青葙子苷A治療后能夠明顯抑制AHNP誘導的肝組織損傷時NF-кB蛋白的表達,但青葙子苷A究竟通過何種途徑抑制NF-кB的核活性和轉(zhuǎn)位,其具體機制有待進一步的研究探討。

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