黃春連+范雪梅+黎倩+王義明+王淑美+龔夢鵑+羅國安

[摘要]考察制何首烏水提物作用后大鼠肝臟P450酶5種亞型的mRNA表達(dá)變化。SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、制何首烏高、低劑量組（540，108 g·kg-1），連續(xù)灌胃給藥7 d。給藥結(jié)束后，檢測大鼠血清生化指標(biāo)，并采用實(shí)時熒光定量PCR測定各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟P450酶5種亞型mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AST在高、低劑量組都顯著下降；ALT在低劑量組顯著降低，在高劑量組顯著升高。高、低劑量組的大鼠肝組織P450酶5種亞型mRNA的表達(dá)均下調(diào)，且下調(diào)程度與給藥劑量成一定的劑量性依賴。特別是高劑量制何首烏水提物能夠顯著抑制大鼠的CYP1A2和CYP2E1的mRNA表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)大劑量制何首烏水提物具有肝毒性，且隨著劑量增加其肝損傷程度增加。其中制何首烏水提物540 g·kg-1對大鼠肝CYP1A2和CYP2E1的mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用。

[關(guān)鍵詞]制何首烏水提物； 肝損傷； P450酶； 血清生化指標(biāo)； mRNA表達(dá)

Effect of processed Polygonum multiflorum on mRNA

expression level of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver

HUANG Chunlian1，2， FAN Xuemei2*， LI Qian3， WANG Yiming2， WANG Shumei1， GONG Mengjuan1*， LUO Guoan1，2

（1School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；

2 Department of Chemistry， Tsinghua University， Beijing 100084， China；

3 Guangzhou Consun Pharmaceutical Co， Ltd， Guangzhou 510610， China）

[Abstract]To observe the effect of processed Polygonum multiflorum on mRNA expression levels of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver SD rats were randomly divided into the normal control group， processed P multiflorum high dose and low dose groups （540 g·kg-1 and 108 g·kg-1） The rats in administration groups were continuously given with processed P mutiflorum for 7 days by ig administration， and the rats in normal control group were given with the same volume of distilled water After successive administration of 7 days， the serum biochemical indications were detected， and Realtime quantitative PCR technology was used to detect the mRNA expression levels of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver Experimental results showed that AST was decreased significantly in both low and high dose groups ALT was significantly decreased in low dose group and significantly increased in high dose group The mRNA expression levels of five subtypes of CYP450 enzymes in rat liver were decreased in high dose and low dose groups in a dosedependent manner Especially the high dose processed P multiflorum could significantly inhibit CYP1A2 and CYP2E1 mRNA expression levels in rats The study showed that high dose P multiflorum water extract had hepatotoxicity， and the degree of liver damage was increased with the increase of dose It shall be noted that 540 g·kg-1 water extract of P multiflorum could significantly inhibit CYP1A2 and CYP2E1 mRNA expression levels in the liver of rats

[Key words]processed Polygonum multiflorum； liver injury； CYP450； serum biochemical indicators； mRNA expression

細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）是人體內(nèi)重要的藥物代謝氧化酶，能夠催化多種藥物、前毒物、強(qiáng)致癌物等外源性物質(zhì)的氧化還原代謝[1]。在生物轉(zhuǎn)化過程中起到非常重要的地位。同時，它也會受到藥物的影響[2]。近年來，CYP450在中藥代謝方面逐漸受到人們的關(guān)注。研究中藥作用于CYP450酶的表達(dá)，有助于預(yù)測臨床藥物相互間的作用，提高中藥的療效與安全性[3]。

何首烏是蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根，制何首烏為何首烏炮制加工而來，炮制后具有補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨的功效。從古到今常用作補(bǔ)藥，在臨床上多與其他藥物配伍使用。但是近年來，臨床上常見制何首烏能夠引起肝臟損傷的報道[45]。本研究以制何首烏水提物為研究對象，考察其對大鼠肝臟CYP1A2，CYP2E1，CYP3A1（相當(dāng)于人的CYP3A4），CYP2D6，CYP2C11（相當(dāng)于人的CYP2C9）P450酶5種亞型的mRNA表達(dá)影響，有利于預(yù)測制何首烏與其他臨床藥物之間可能存在的相互作用，從而指導(dǎo)臨床安全合理用藥，降低潛在的風(fēng)險。

1材料

11動物與分組清潔型雄性SD大鼠，體重（200±10）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK（京）20120001，由清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心分籠飼養(yǎng)（批準(zhǔn)號16LAG2）。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成3組，每組6只：正常組（空白對照，給予蒸餾水）、制何首烏低劑量組（108 g·kg-1，相當(dāng)于臨床劑量10倍）和高劑量組（540 g·kg-1，相當(dāng)于臨床劑量的50倍）。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

12試劑制何首烏水提取物由廣州康臣藥業(yè)基地中心提供（批號20160525）；Power SYBRGreen PCR Master Mix（美國ABI，批號1310428）；RNase free water（美國Invitrogen，批號3626C311）；Trizol Reagent（美國Invitrogen，批號94302）；10%水合氯醛（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20110210）；PBS（HyClone，美國，批號AAF203865）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號B16030706）；無水乙醇、氯仿、異丙醇（批號分別為20160502，0150232，20150508，北京化工廠）。

13儀器GSTORM基因擴(kuò)增儀（英國）；ABI Prism 7300實(shí)時熒光定量PCR儀（美國）；XP205 型電子天平（Mettlertoledo，瑞士）；低溫高速離心機(jī)（Hettich，德國）；生物分光光度計（Eppendorf，德國）。

2方法

21標(biāo)本采集連續(xù)7 d給藥結(jié)束后，禁食12 h，自由飲水，稱各組大鼠體重。10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速打開腹腔肝門靜脈取血，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清；然后迅速取大鼠肝臟，冰冷的生理鹽水清洗，用濾紙吸干，稱重，保存于液氮中。

22肝重指數(shù)的測定根據(jù)給藥結(jié)束時大鼠的體重和肝重計算肝重指數(shù)，肝重指數(shù)=肝重/體重×100%。

23血清生化指標(biāo)檢測檢測大鼠血清中的8個生化指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）能敏感的反映肝細(xì)胞是否發(fā)生損傷及損傷程度；白蛋白/球蛋白（A/G）和總蛋白定量（TP）可反映肝合成功能；總膽紅素（TBIL）可反映膽紅素代謝及膽汁淤積情況；甘油三酯（TG）可反映脂質(zhì)代謝異常；白蛋白（ALB）可反映蛋白代謝異常。堿性磷酸酶（ALP）可反映膽汁淤積性疾病。按試劑盒說明書全自動生化儀檢測。

24肝臟組織總RNA的提取及濃度測定取液氮中凍存的大鼠肝臟組織50 mg置于已除RNA酶的研缽中，在液氮條件下研磨，按 Trizol RNA提取試劑盒操作說明提取各組大鼠肝臟組織中的總RNA。利用生物分光光度計測定提取總RNA的濃度及A值?？俁NA樣本的A260/A280均介于180～210即符合實(shí)驗(yàn)要求。

25引物設(shè)計及特異性驗(yàn)證考察基因GAPDH，CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A1的引物使用Primer 30設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列信息和擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

對看家基因GAPDH及CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A引物的特異性進(jìn)行考察。

隨機(jī)選擇2個樣本進(jìn)行上述基因的實(shí)時熒光定量PCR（RTPCR）反應(yīng)，若擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，則說明引物特異好，可以用于定量測定。

26RTPCR測定將大鼠肝組織提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按下述體系進(jìn)行RTPCR反應(yīng)：10 μL Power SYBRGreen PCR Master Mix，上、下游引物各040 μL，cDNA 模板1 μL，Rnasefree Water 820 μL，總計20 μL。RTPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。用RTPCR儀自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，得出Ct，結(jié)果采用絕對定量法計算mRNA的表達(dá)量。首先建立各基因的濃度和Ct測定值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出樣本中各基因的拷貝值，然后根據(jù)看家基因進(jìn)行歸一化處理，計算結(jié)果使用目的基因與看家基因GAPDH拷貝數(shù)的比值表示。

27數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果用±s表示。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 210統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

31對大鼠肝重指數(shù)變化的影響各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝重指數(shù)沒有明顯變化，說明制何首烏水提物對大鼠肝重沒有影響。

32大鼠血清生化指標(biāo)變化與正常對照組比較，ALT在低劑量組顯著下降，而在高劑量組中顯著升高；AST在高、低劑量組中都顯著下降。說明給藥劑量的不同對大鼠肝細(xì)胞造成不同程度的損傷。給藥組大鼠血清中TBIL和ALP雖然有變化，但不顯著。說明給藥對大鼠膽紅素代謝及膽汁淤積方面有一定的影響。不同給藥劑量組大鼠血清生化指標(biāo)A/G，TP，ALB，TG沒有顯著性的變化，說明藥物對大鼠肝臟的合成功能，脂質(zhì)代謝和蛋白代謝等方面無明顯影響，見表2。

33引物特異性驗(yàn)證GAPDH，CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A1基因RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線都為單一特異性峰，證明實(shí)時熒光定量PCR中的熒光均為目的基因cDNA擴(kuò)增雙鏈DNA發(fā)出的熒光，引物特異好，可進(jìn)行下一步定量測定。

34RTPCR定量測定采用絕對定量法對目的基因進(jìn)行分析，建立了6個基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別為GAPDH：Y=-5299X+5259（R2=0999）；CYP1A2：Y=-4842X+571（R2=0994）；CYP2C11：Y=-4617X+571（R2=0998）；CYP2D4：Y=-4022X+521（R2=0990）；CYP2E1：Y=-4687X+5288（R2=0991）；CYP3A1：Y=-4555X+546（R2=0999）。其中Y為濃度，X為RTPCR測定的Ct。通過RTPCR測定得到的各樣本中GAPDH，CYP1A2，CYP2C11，CYP2D4，CYP2E1，CYP3A1基因的Ct，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算其含量，并參照看家基因GAPDH進(jìn)行歸一化后，見表3。可以看出，與正常組相比較，不同劑量的制何首烏水提物均能夠抑制大鼠肝組織中P450酶5種亞型的mRNA表達(dá)，且抑制程度與給藥劑量成一定劑量依賴性。其中540 g·kg-1高劑量制何首烏水提物能夠顯著的抑制大鼠CYP1A2和CYP2E1的mRNA表達(dá)，而108 g·kg-1低劑量制何首烏水提物雖然也具有抑制作用，但與正常組比較，不存在顯著性差異。

4討論

制何首烏是臨床中常用來烏發(fā)補(bǔ)益的中藥。但近年來，屢見文獻(xiàn)報道制何首烏可導(dǎo)致不良反應(yīng)，特別是肝毒性[6]，嚴(yán)重威脅了患者臨床的安全用藥。目前國內(nèi)、外對于制何首烏的肝毒性也在不斷的深入研究[78]。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的制何首烏給藥短期可對大鼠的肝臟產(chǎn)生不同程度的損傷作用，并且能夠抑制CYP450酶mRNA的表達(dá)，特別是對CYP1A2和CYP2E1的抑制作用顯著，因此臨床上需要注意制何首烏與其他藥物聯(lián)用時產(chǎn)生的不良后果。

本研究結(jié)果顯示，大劑量制何首烏短期給藥對大鼠的肝重指數(shù)沒有影響，但血清生化指標(biāo)測定發(fā)現(xiàn)給藥后大鼠血清中ALT，AST，TBIL，ALP水平發(fā)生變化。ALT在高劑量組中顯著性升高，說明高劑量何首烏造成了大鼠肝臟細(xì)胞的壞死，這與涂燦等[9]研究何首烏炮制前后對大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標(biāo)篩選的研究中肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致ALT升高的結(jié)果相符。低劑量組ALT和高、低劑量組中AST都顯著降低，表明肝組織發(fā)生慢性輕度損傷。李玥等[10]在觀察制何首烏醇提物不同劑量長期給藥對小鼠肝臟的影響結(jié)果中，ALT，AST在發(fā)生急性肝損傷、重度損傷時，ALT，AST明顯升高，而發(fā)生慢性輕度損傷時，ALT，AST變化不明顯或者可能發(fā)生顯著下降。制何首烏高劑量組的大鼠血清中TBIL升高，肝臟將間接膽紅素轉(zhuǎn)化為直接膽紅素的能力下降，說明肝細(xì)胞受損。與胡錫琴等[11]在研究何首烏鞣質(zhì)對大鼠肝臟生化指標(biāo)的影響結(jié)果中肝臟發(fā)生炎癥、壞死、中毒等損害時引起血清TBIL升高的結(jié)果一致。TBIL病理性降低見于慢性肝炎和再生障礙性貧血。研究結(jié)果顯示不同劑量制何首烏組的ALP相對于正常對照組都降低，ALP病理性降低，說明肝臟出現(xiàn)膽汁淤積或者慢性的肝損傷現(xiàn)象。

在此基礎(chǔ)上，P450酶5種亞型mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，高、低劑量的制何首烏水提物均能夠抑制肝組織P450酶5種亞型mRNA的表達(dá)，且抑制程度與給藥劑量成一定的劑量性依賴。特別是對CYP1A2和CYP2E1，高劑量的制何首烏顯著抑制這2個酶的mRNA表達(dá)。李浩等[12]研究何首烏水提物對大鼠肝臟CYP1A2，CYP2E1酶活性及mRNA表達(dá)抑制作用研究；還有研究發(fā)現(xiàn)[13]，大鼠灌胃制何首烏90 d，可抑制大鼠肝臟CYP2E1 mRNA的表達(dá)。

本研究結(jié)合大鼠血清生化指標(biāo)測定與肝組織P450酶5種亞型mRNA的表達(dá)的測定結(jié)果，表明制何首烏對mRNA表達(dá)水平的調(diào)控可能是其導(dǎo)致肝損傷的作用機(jī)制之一。制何首烏通過抑制P450酶5種亞型mRNA的表達(dá)，可能導(dǎo)致其酶活性降低，從而造成制何首烏中某些肝毒性成分在肝臟中積聚，導(dǎo)致肝組織出現(xiàn)不同程度的損傷。該研究結(jié)果有助于防范制何首烏用藥引起的不良反應(yīng)，并為臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Huang Q， Deshmukh R S， Ericksen S S， et al Preferred binding orientations of phenacetin in CYP1A1 and CYP1A2 are associated with isoformselective metabolism[J] Drug Metab Dispos， 2012， 40（12）： 2324

[2]于敏，張雙慶，聞鎳，等細(xì)胞色素P450酶系體外藥物代謝研究方法進(jìn)展[J]中國藥事，2013， 27（1）： 81

[3]Mehra D， Sternberg D I， Jia Y， et al Altered lymphocyte trafficking and diminished airway reactivity in transgenic mice expressing human MMP9 in a mouse model of asthma[J]Am J Phys Med Rehabil，2010，298（2）：189

[4]衛(wèi)培峰，胡錫琴，嚴(yán)愛娟何首烏所致不良反應(yīng)概況[J]陜西中醫(yī)，2004，25（2）：170

[5]羅瑞芝，賈偉，趙利斌，等何首烏研究進(jìn)展[J]中草藥，2005，36（7）：1097

[6]陳媛媛，郭芳，王文軍，等丹參聯(lián)合川芎嗪對肺纖維化大鼠肺組織JAK1， STAT1， ICAM1 表達(dá)的影響[J]瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，35（1）：6

[7]張思玉，朱曉光，張廣平，等制首烏提取液毒理學(xué)研究[J]毒理學(xué)雜志，2013，27（4）：261

[8]李曉菲，李娜，涂燦，等基于內(nèi)毒素特異質(zhì)模型的生首烏與制首烏肝毒性比較研究[J]中草藥，2015，46（10）：1481

[9]涂燦，蔣冰倩，趙艷玲，等何首烏炮制前后對大鼠肝臟的損傷比較及敏感指標(biāo)篩選[J]中國中藥雜志，2015，40（4）：654

[10]李玥，徐立，劉若囡，等生、制首烏醇提物對小鼠肝臟的影響[J]海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011， 17（4）： 452

[11]胡錫琴，李婭琳，王磊何首烏中鞣質(zhì)對大鼠肝臟生化指標(biāo)的影響[J]藥物評價研究，2010（1）： 63

[12]李浩，楊紅莉，李登科，等何首烏水提物對大鼠肝臟 CYP1A2， CYP2E1 酶活性及 mRNA 表達(dá)抑制作用研究[J]中國中藥雜志，2015，40（7）：1370

[13]衛(wèi)培峰，張敏，焦晨莉，等何首烏不同炮制品對大鼠肝臟CYP2E1基因 mRNA 表達(dá)的影響[J]中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010， 30（17）：1445

[責(zé)任編輯張寧寧]

[收稿日期]20161011

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81130066，81302731）

[通信作者] *范雪梅，高級工程師， 主要從事分子藥理學(xué)研究，Tel/Fax：（010）62781688，Email：xuemeifan@tsinghuaeducn；*龔夢鵑，副教授，主要從事中藥藥理研究，Tel/Fax： （020）39352612，Email：gongmengjuan@139com

[作者簡介]黃春連，碩士研究生，Tel/Fax：（010）62781688，Email：738621544@qqcom