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        全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳測定艾塞那肽等電點

        2014-10-27 09:04:42劉潔欣方均建王心正李海靜程建華吳勝明董方霆
        生物技術(shù)通訊 2014年3期
        關(guān)鍵詞:毛細(xì)管柱艾塞那等電點

        劉潔欣,方均建,王心正,李海靜,程建華,吳勝明,董方霆

        國家生物醫(yī)學(xué)分析中心,北京 100850

        艾塞那肽是一種人工合成的含有39個氨基酸殘基的新型糖尿病治療藥物,為胰高血糖素樣肽-1類似物,對2型糖尿病患者的血糖有控制作用,能夠促進(jìn)胰腺β細(xì)胞增殖和胰島素的分泌,抑制胰高血糖素的分泌及減緩胃排空[1]。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2005年批準(zhǔn)其上市,是近年來首個在全球范圍內(nèi)獲批的新型治療2型糖尿病的藥物。等電點是多肽和蛋白質(zhì)類藥物質(zhì)量控制的重要指征,它可以反映生物技術(shù)合成的多肽、蛋白質(zhì)類藥物的純度和空間構(gòu)象的均一性,以及生產(chǎn)過程中的可靠性,缺失肽、斷裂肽、酰胺化/去酰胺化、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護(hù)[2]、多糖唾液酸化[3]等一些修飾都會改變樣品的等電點,影響藥物的生物活性。因此,等電點的準(zhǔn)確測定對于多肽、蛋白類藥物的質(zhì)量控制和新藥研發(fā)起著重要作用。

        新一代的全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳技術(shù)(capillary isoelectric focusing-whole column imag?ing detection,CIEF-WCID)[4-5]成功地解決了這一問題,這是一種將毛細(xì)管等電聚焦電泳與全柱成像技術(shù)相結(jié)合的新型電泳系統(tǒng)。當(dāng)樣品進(jìn)行等電聚焦時,互補性金屬氧化物半導(dǎo)體(complementary met?al-oxide-semiconductor translator,CMOS)作為成像檢測技術(shù),可以對整個聚焦分離通道、聚焦過程進(jìn)行實時監(jiān)控和記錄,這個過程中不移動毛細(xì)管柱,也無須移動樣品。該方法使得分析結(jié)果不受干擾,提高了樣品等電點測定的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。并且通常能在幾分鐘內(nèi)完成分析測定,所需時間大大縮短,可實現(xiàn)高通量檢測。另外,CIEF-WCID在復(fù)雜樣品等電點測定[6]、蛋白質(zhì)純度分析、蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量控制、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究[7]、相對分子質(zhì)量測定[8]、藥物與蛋白質(zhì)相互作用[9]等多個研究領(lǐng)域也有著重要的應(yīng)用。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        艾塞那肽為國內(nèi)公司生產(chǎn);多肽(pI 6.60、7.40、8.50)、線性固相pH梯度膠條pI 3-10L購自BIORAD公司;載體兩性電解質(zhì)3-10、陽極電解液(0.1 mol/L H3PO4)、陰極電解液(0.1 mol/L NaOH)和marker(pI 4.65、5.91、6.14、6.61、7.05、7.40、7.90、8.18、9.22)均由 Advanced Electrophoresis Solutions公司提供;CEInfinite全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳儀購自Advanced Electrophoresis Solutions公司;PROTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀購自BIO-RAD公司;Centrifuge 5415D離心機(jī)購自Eppordorf公司;實驗用水均為Milli-Q(Millipore公司)系統(tǒng)制備。

        1.2 待測樣品

        將艾塞那肽樣品配制成濃度為0.125 mg/mL的溶液,取100 μL該溶液與100 μL載體兩性電解質(zhì)混合,加入marker(pI 4.65、6.14)各2 μL,充分混勻,13 200 r/min離心1 min后取上清進(jìn)樣3次。

        1.3 CIEF-WCID電泳

        全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳儀中的毛細(xì)管柱一端連接自動進(jìn)樣器,另一端接入廢液瓶中。當(dāng)陰陽極電解液兩端通入高壓直流電后,載體兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管柱內(nèi)形成pH梯度,樣品在50 mm的分離通道內(nèi)根據(jù)所帶電性向陽極或陰極移動,當(dāng)樣品移動到與其等電點相同的pH值時,該樣品凈電荷為零,即完成等電聚焦分離。

        實驗中采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣,上樣量50 μL。等電聚焦過程設(shè)置為首先1000 V電壓聚焦1 min,然后2000 V聚焦1 min,最后3000 V聚焦4 min。在聚焦過程中采用采用CMOS成像技術(shù)對毛細(xì)管柱進(jìn)行全程動態(tài)成像檢測,檢測信號為紫外吸收強度。

        1.4 凝膠等電聚焦電泳

        在30 μg艾塞那肽樣品中加入1.75 μL IPG緩沖液和348 μL重泡脹液,振蕩混勻,離心后上樣。等電聚焦過程為重泡脹1 h、30 V 10 h、500 V 30 min、2000 V 30 min、5000 V 30 min、8000 V 1 h、10 000 V 4 h,最后用考馬斯亮藍(lán)R250染色,50%甲醇脫色至條帶清晰。

        1.5 方法驗證

        1.5.1 準(zhǔn)確性驗證 采用BIO-RAD公司已知等電點的多肽驗證檢測方法的準(zhǔn)確性。將已知等電點多肽(pI 6.60、7.40、8.50)分別稀釋至1/25,取多肽樣品各 22 μL、載體兩性電解質(zhì)300 μL,分別加入適宜marker各3 μL,充分混勻,13 200 r/min離心1 min后取上清進(jìn)樣。

        1.5.2 重復(fù)性驗證 將marker(pI 4.65、6.14、7.40)各4 μl加入400 μL載體兩性電解質(zhì)中,充分混勻,13 200 r/min離心1 min,取上清連續(xù)進(jìn)樣6次。

        2 結(jié)果

        2.1 準(zhǔn)確性驗證

        將BIO-RAD公司已知多肽(pI 6.60、7.40、8.50)作為未知樣品進(jìn)行等電點的測定,圖1為多肽(pI 6.60)等電聚焦電泳圖,根據(jù)聚焦完成時等電點到兩端marker的距離計算得到等電點為6.73,對參考值相對誤差為1.97%。其他多肽等電點測定結(jié)果見表1,相對誤差在2.5%以內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.08%。以上結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好,能夠用于對未知樣品的等電點測定。

        2.2 重復(fù)性驗證

        對系統(tǒng)重復(fù)性進(jìn)行了考察。圖2為marker(pI 4.65、6.14、7.40)與兩性電解質(zhì)的混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6次的等電聚焦電泳圖,marker峰形和峰位無明顯變化,峰位相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.5%。重復(fù)性良好,表明該方法能夠滿足實驗要求。

        2.3 艾塞那肽等電點測定

        圖1 CIEF-WCID測定多肽(pI 6.60)電泳圖(marker pI 5.91、7.05)

        表1 CIEF-WCID測定3種多肽的等電點結(jié)果

        CIEF-WCID因采用全柱成像技術(shù),能夠?qū)崟r記錄樣品動態(tài)聚焦過程。圖3為艾塞那肽的等電聚焦過程。在未聚焦時,樣品均勻分布在毛細(xì)管中,開始聚焦后,樣品由陽極和陰極向等電點處移動,到360 s時譜圖不再改變,表明樣品聚焦完全。實時全柱成像技術(shù)不僅可以顯示蛋白質(zhì)等電聚焦過程,而且可以及時反映聚焦是否完成,以避免聚焦時間過長引起蛋白質(zhì)沉淀。

        采用CIEF-WCID對艾塞那肽的等電點進(jìn)行測定時,所用marker的pI為4.65和6.14,連續(xù)進(jìn)樣3次,結(jié)果如圖4所示,分別測得艾塞那肽等電點為5.46、5.45和5.46,平均值為5.46,變異系數(shù)為0.11%,檢測所需時間僅為6 min。另外,還采用凝膠等電聚焦電泳測定了艾塞那肽的等電點,結(jié)果如圖5,電泳測得的艾塞那肽的等電點為5.40,所需時間為18 h,是CIEF-WCID方法的近200倍。結(jié)果表明,CIEF-WCID測定等電點的方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性均良好,而且相比凝膠等電聚焦電泳能大大縮短檢測時間。

        圖2 marker(pI 4.65、6.14、7.40)連續(xù)進(jìn)樣6次CIEF-WCID電泳圖

        圖3 CIEF-WCID測定艾塞那肽等電點的動態(tài)聚焦過程聚焦時間分別為40、60、360 s

        3 討論

        CIEF-WCID是在毛細(xì)管等電聚焦電泳的基礎(chǔ)上,采用全柱成像技術(shù),聚焦和檢測過程不移動毛細(xì)管柱即可實現(xiàn)對樣品的檢測,通過實時記錄動態(tài)聚焦過程,確定最佳聚焦時間,使得檢測結(jié)果更加真實可靠,且檢測時間大幅度縮短。凝膠電泳與CIEFWCID相比,存在分析時間長、自動化程度低的問題;而傳統(tǒng)的毛細(xì)管等電聚焦電泳雖然能克服這些不足,縮短檢測時間,但由于檢測器為單點檢測器,聚焦完成后需要移動樣品通過檢測窗口,因此在移動的過程中可能會造成pH梯度改變、分辨率下降、蛋白質(zhì)沉淀,從而影響分析測試結(jié)果[10]。本實驗對CIEF-WCID方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察,對不同等電點的樣品均能準(zhǔn)確測定;在重復(fù)實驗中,marker峰形和峰位基本無明顯變化。這表明該技術(shù)準(zhǔn)確度、重復(fù)性良好,能夠應(yīng)用于樣品等電點的測定。對于艾塞那肽等電點的測定,CIEF-WCID與凝膠等電聚焦電泳結(jié)果之間無明顯差別,但CIEF-WCID方法自動化程度高,可自動進(jìn)樣,對于聚焦過程可以實時記錄,聚焦時間上也縮短至幾十分之一,而且無需染色、脫色等步驟,比凝膠等電聚焦電泳方法更加方便快捷。綜上所述,應(yīng)用CIEF-WCID可以很好地對艾塞那肽等電點進(jìn)行分析,所需時間短,準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好,相比于其他電泳技術(shù)具有高通量的優(yōu)勢,這將為多肽的質(zhì)量控制提供一種更為高效的方法。

        圖4 連續(xù)3次CIEF-WCID測定艾塞那肽等電點結(jié)果

        圖5 凝膠電泳測定艾塞那肽等電點

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